2016神经生物学实验讲义.doc

徐州医科大学神经生物学实验讲义 实验一 鼠脑灌注固定取材 、 原理固定是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞的溶解和腐败，并保持其原来的细微结构及原位保持生物活性物质的活性；能使细胞内蛋白质、脂肪、糖、等各种成分沉淀而凝固，尽量保持它原有的结构；使细胞内的成分产生不同的折射率，造成光学上的差异，使得原本在生活情况下看不清楚的结构，变得清晰可见；使得组织细胞各部经媒染作用容易染色；经过固定，使组织硬化，以利于以后切片时切薄片。体循环：左心室升主动脉主动脉的各级分支毛细血管各级静脉上下腔静脉右心房，完成体循环的整个循环、实验步骤 1正常Sprague-Dawley大鼠，150～250g，雌雄不拘动物麻醉后，用左手持镊子夹起腹部皮肤，右手持剪刀自胸骨剑突下腹部剪一小口，由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌，分离皮下组织，将皮肤翻向两侧，再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨，沿膈肌向两侧剪开，并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧，将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏小心用镊子将心包打开灌注针插入左心室并送至主动脉内，同时剪开右心耳，使血液排出。先快速灌注0.9%Nal（大鼠 80-120ml，至肝脏逐渐变白色右心耳流出清亮液体为止，再灌注4℃固定液ml，根据动物体重定量，其中前1/3量快速灌注，后2/3量慢灌注，共在30分钟内灌注完固定液进入血管后，大鼠四肢抽动，表明灌注液进入大鼠大脑，待抽动完全停止，全身组织器官变硬后即可剥离颅骨、剪断脑神经、离断脑于脊髓，取出整脑。 后固定（post-fixed）出鼠脑后，相同固定液4～12h，4℃。 二 立体定位一、目的和应用 脑立体定位仪是利用颅骨外面的标志或其它参考点所规定的三坐标系统来确定皮层下某些神经结构的位置是神经解剖、神经生理、神经药理和神经外科等领域内的重要研究设备，以便在非直视暴露下对其进行定向的刺激、破坏、注射药物、引导电位等研究。可用于帕金森氏病、癫痫、脑内肿瘤动物模型建立，学习记忆，脑内神经干细胞移植，脑缺血等研究。 二、步骤 1、实验动物的选择：正常Sprague-Dawley大鼠，150～250g，雌雄不拘2、麻醉（anesthetized）：10%水合氯醛0.35ml/100g，ip.； 3、定位：用耳棒和上颌固定器将大鼠头部固定在动物脑立体定位仪上，调使前囟点和人字缝尖点在同一水平面上碘伏消毒皮肤，根据所选区域切开皮肤，3%双氧水擦拭骨膜，前囟点4、参照Paxinos and Watson1986）的鼠脑图谱，注射部位， 6、缓慢注射液体注射速度2μl/5min注射后留针10～15min、根据实验需要，决定动物存活时间。 实验三 冰冻切片及贴片 、组织块浸糖 目的：冰冻时，组织中水分易形成冰晶，对组织结构有影响，故将组织浸入20%-30%的糖液中是为了置换出组织中大部分水分，使其在切片时尽量少出现冰晶。将鼠脑从后固定液移入15%蔗糖0.1mol/L PB，4℃，过夜；再移入30%蔗糖0.1mol/L PB，4℃，至组织块沉底、冰冻切片 调节好台；鼠脑冰冻连续冠状切片，片厚20μm。按顺序收集切片于盛有0.01 mol/L PBS的内。 、贴片平整贴片于粘附上，凉干后。一张优质的切片要求完整，厚薄均匀，无刀痕皱褶。0.01mol/L PBS（pH 7.4）： Na2HPO4 3.75g NaH2PO4 0.43g NaCl 7.2g 加水定容至 1000ml 0.1mol/L PB（pH 7.4）： Na2HPO4 28.7g NaH2PO4 2.96g 加水定容至 1000ml %蔗糖： g 加 0.1mol/L PB溶解定容至100ml 30%蔗糖： 30g 加 0.1mol/L PB溶解定容至100ml 实验四Nissl）染色（Nissl body）焦油紫亚甲蓝甲苯胺蓝硫等其染为蓝色 二、实验步骤 1 浸片切片min； 2、 染色切片入0.1%焦油紫水溶液37℃，30～60分钟3、 漂洗：蒸馏水洗去浮色4、分色、脱水、透明依次移入70%、80% 95%（两次，每；移入100%两次，每次1；移入二甲苯两次，每次5-10 5、封片：中性树胶封片。 结果：尼氏小体紫红色，核呈深蓝色，背景无色。 、 注意1、在70%、80%内分色作用明显