2转座酶的原核表达与其DNA结合活性.PDF

文章编号：１６７４５５６６（２０１７）０３０３３９０９ ＤＯＩ：１０．１２０２４／ｊｓｏｕ．２０１６１００１８８１ 金鱼Ｔｇｆ２转座酶的原核表达及其ＤＮＡ结合活性 １ １ １ ２ １，２ 司蕊蕊 ，赵　茜 ，卢梦琪 ，邹曙明 ，蒋霞云 （１．上海海洋大学 食品学院，上海　２０１３０６；２．上海海洋大学 农业部种质资源与利用重点开放实验室，上海　２０１３０６） 摘　要：金鱼Ｔｇｆ２转座子基因属于Ｈｏｂｏ／Ａｃｔｉｖａｔｏｒ／Ｔａｍ３（ｈＡＴ）超家族，其编码的活性转座酶能在多种鱼类转 座中介导基因插入及诱变，因此在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释及育种等方面具有重要的应用前 景。鉴于Ｔｇｆ２转座酶基因（ＪＮ８８６５９１）存在众多稀有密码子，本研究依据大肠杆菌对密码子的偏好性，对金鱼 Ｔｇｆ２转座酶基因进行密码子优化，所得Ｔｇｆ２转座酶基因连接原核表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋），将重组载体转化到 大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）细胞。该大肠杆菌细胞在培养温度３７℃、ＯＤ ０．５时用ＩＰＴＧ诱导获得高效表达，即 ≈ ６００ 菌体中含有８．８％的重组蛋白，上清液中含有４．０％重组蛋白。采用亲和层析纯化从菌体上清液中分离得到 分子量约７０ｋｕ的可溶性重组蛋白，经ＭＡＬＤＩ（ＴＯＦ）／ＴＯＦ串联质谱鉴定其为重组Ｔｇｆ２转座酶。进而采用分 子排阻色谱法研究转座酶的ＤＮＡ结合活性，结果表明：所得重组 Ｔｇｆ２转座酶能识别并结合含 Ｔｇｆ２转座子特 异性亚末端重复序列的ＤＮＡ探针，即启动转座。采用原核表达体系高效获得重组 Ｔｇｆ２转座酶，为其作为工 具酶应用于鱼类生物学研究奠定必要的基础。 关键词：Ｔｇｆ２；转座酶；原核表达；ＤＮＡ结合活性 中图分类号：Ｓ９１７　　　文献标志码：Ａ 　　转座子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）是一类能够在基因组中 期研究显示：大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中以低温 移 动 的 遗 传 因 子，其 过 程 称 为 转 座 （２２℃）、低吸光度（ＯＤ ０．３）条件下诱导，可 ≈ ６００ （ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）。随着多个基因组测序计划的进 ［１８］ 表达可溶、活性的Ｔｇｆ２转座酶 。鉴于大肠杆 行，原核和真核生物界陆续发现众多转座子，转 菌ＢＬ２１菌株表达外源蛋白有更高的效率和稳定 座子因此被认为是自然界变异和进化的重要推 性，本研究根据大肠杆菌的密码子偏好性，优化 ［１２］ 并合成了金鱼 Ｔｇｆ２转座酶编码区基因，与ｐＥＴ 动力之一 。转座子可介导基因组插入突变、 基因重排、基因修饰及基因治疗［３６］，因此有望开 ２８ａ（＋）载体重组，采用大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）作 ［７９］ 为宿主菌株，以期获得 Ｔｇｆ２转座酶的高效表达， 发成为重要的遗传学、生物学工具 。 ＤＮＡ转座子在宿主基因组通过“剪切粘贴” 为Ｔｇｆ２转座酶的发酵生产及应用创造先决条件。 的机制变更位置［１０１１］。自主的ＤＮＡ转座子能编 １　材料与方法 码活性转座酶［１２１３］以介导转座过程，但由于受到 来自宿主的钝化作用，迄今自然界生物体内仅发 １．１　质粒、菌种和试剂 ｐＥＴ２８ａ（＋）为本实验室保存；ＢＬ２１（ＤＥ３）、 现极少数的天然活性转座子，如 Ｔｏｌ２、ＰｉｇｇｙＢａｃ、 ［１