3a基因的克隆与分析.PDF

— ６８— 江苏农业科学　２０１６年第４４卷第１２期 仇保丰，董蓉莲，宋鸿雁，等．柔嫩艾美耳球虫核糖体蛋白Ｓ３ａ基因的克隆及分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（１２）：６８－７１． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．１２．０１７ 柔嫩艾美耳球虫核糖体蛋白Ｓ３ａ基因的克隆及分析 １ ２ ３ １ ３ １ ３ １ １ 仇保丰 ，董蓉莲 ，宋鸿雁 ，顾炳泉 ，景　瑾 ，刘文斌 ，邵义祥 ，高逢结 ，李　建 （１．南通出入境检验检疫局，江苏南通２２６００４；２．江苏省疾病预防控制中心，江苏南京２１０００９；３．南通大学实验动物中心，江苏南通２２６００１） 　　摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中收录的柔嫩艾美耳球虫核糖体蛋白Ｓ３ａ基因序列，利用计算机软件设计 １对引物，从纯化 的柔嫩艾美耳球虫第２代裂殖子中提取总ＲＮＡ，然后应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出约８１０ｂｐ的产物，将其连入ｐＭＤ１８－ Ｔ载体，经双酶切和ＰＣＲ鉴定正确后，进一步进行ＤＮＡ序列测定。将本研究测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ收录的柔嫩艾美耳 球虫Ｓ３ａ基因进行比对，发现两序列间有６个碱基发生突变，其中３个为无义突变，其余为有义突变，同源性为 ９７９％；本研究扩增的Ｓ３ａ基因包含了一个全长７９５ｂｐ的完整开放阅读框（ＯＲＦ），编码２６４个氨基酸，蛋白分子量约 为２９．９ＫＤ，ＯＲＦ碱基同源性为９９．０％，推导氨基酸序列同源性为９８．１％。将本研究克隆的核糖体蛋白Ｓ３ａ基因与 ＧｅｎＢａｎｋ中收录的人和哺乳动物、植物、真菌、禽鸟等共 １５种真核生物的核糖体蛋白Ｓ３ａ基因进行比对发现，虽然本 研究克隆和ＧｅｎＢａｎｋ中收录的柔嫩艾美耳球虫Ｓ３ａ基因之间同源性最高，但是两者却与硕大利什曼原虫和布氏锥虫 这２种原虫的Ｓ３ａ基因同源性较低，反而与禽鸟Ｓ３ａ基因的同源性较高。 　　关键词：柔嫩艾美耳球虫；Ｓ３ａ基因；克隆；分析 　　中图分类号：Ｑ７８５　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１６）１２－００６８－０３ 　　鸡柔嫩艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌｌａ）Ｓ３ａ基因是从 Ｅ． １．１．２　试验鸡　１日龄ＡＡ肉鸡购自江苏南通某商品鸡孵化 ｔｅｎｅｌｌａ第１代裂殖体 Ｚａｐ ｃＤＮＡ文库中筛选出来的１种 场，饲养于严格消毒无球虫的笼舍中，饲喂的饲料中不含抗球 λ Ⅱ 核糖体蛋白（ＥｔＳ３ａ）基因，由于它与具有调节细胞周期进程 虫药。 和参与蛋白合成的哺乳动物核糖体蛋白ｆｔｅ－１、植物核糖体 １．１．３　试剂　ＤＥＰＣ，购自Ａｍｒｅｓｃｏ公司；Ｍ－ＭＬＶ和 Ｏｌｉｇｏ 蛋白ｃｙｃ－０７和酵母菌核糖体蛋白ＭＦＴ１均具有较高的同源 （ｄＴ）１５Ｐｒｉｍｅｒ，购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ｐＭＤ１８－Ｔ克隆载体、Ｔａｑ 性，且其 ｍＲＮＡ仅在Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ裂殖体和裂殖子阶段能够检 ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ、限制性内切酶ＢａｍＨ 、 Ⅰ 测到，故而推测ＥｔＳ３ａ可能在激发Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ裂殖子和裂殖体 ＥｃｏＲ 和ＤＮＡ胶回收试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有 Ⅰ 发育、黏附和侵袭宿主细胞、适应环境变化等过程中发挥重要 限公司。 ［１］ 的调节作用 。除此之外，Ｃｏｒｄｅｉｒｏ－Ｄａ－Ｓｉｌｖａ等在研究中 １．２　试验方法 发现，硕大利什曼原虫（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｍａｊｏｒ）的Ｓ３ａ蛋白还具有 １．２．１　引物设计和合成　根据ＧｅｎＢａｎｋ中收录的Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ ［２］ 调节Ｔ细胞和Ｂ细胞活性，参与免疫调节的作用 。Ｚｅｍｚｏｕ Ｓ３ａ基因序列，利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计 １对扩增引 ｍｉ等报道硕大利什曼原虫