不可分型流感嗜血杆菌重组Hap蛋白的表达与其生物学活性.PDF

2010;30(5) 南方医科大学学报(JSouthMedUniv) 窑953 窑 不可分型流感嗜血杆菌重组Hap 蛋白的表达及其生物学活性分析 姚 锋袁李婉宜袁邝 玉袁李明远袁丰 锋袁冯 伟袁张 强渊四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室袁四川 成都610041冤 摘要院目的 在原核系统中表达并纯化不可分型流感嗜血杆菌渊NTHi冤的重要粘附因子Hap 蛋白袁并对其免疫原性和粘 2+ 附活性进行初步研究遥 方法 IPTG诱导重组质粒pET32a 渊+冤-Hap在E.coliBL21 中高效表达袁Ni 亲和层析柱纯化表 达产物遥 用纯化的Hap 重组蛋白进行体外竞争黏附实验袁SEM观察及菌落形成单位计数法分析该重组蛋白的黏附活 性遥纯化蛋白与黏膜免疫佐剂CT-B联合鼻腔免疫BALB/C小鼠袁ELIS 检测小鼠抗Hap 的Ig 及IgG抗体水平遥 结 果纯化产物的SDS分析显示获得单一的目的蛋白条带袁Gelanalysis软件分析蛋白纯度可达85%袁 纯化产物超 滤浓缩后袁测得其蛋白浓度为3.2g/L遥 体外竞争黏附实验观察到Hap 重组蛋白的加入可明显抑制NTHi对胞外基质的 黏附袁且细菌黏附量的减少与对照组相比差异具有统计学意义渊P0.01冤遥该重组蛋白与免疫佐剂CT-B联合免疫小鼠袁 可刺激机体产生较高水平的IgG或Ig 抗体袁与重组抗原单独免疫组相比袁差异具有显著性渊P0.05冤遥 结论Hap 蛋白 在原核系统中获得较高浓度和纯度的表达袁纯化Hap 重组蛋白具有良好的免疫原性和粘附活性遥 关键词院不可分型流感嗜血杆菌曰Hap 重组蛋白曰免疫原性曰粘附活性 中图分类号院R183.3;R373.13 文献标识码院 文章编号院1673-4254渊2010冤05-0953-04 ExpressionandbiologicalactivityidentificationofrecombinantHapproteinofNTHi YAOFeng,LIWan-yi,KUANGYu,LIMing-yuan,FENGFeng,FENGWei,ZHANGQiang DepartmentofMicrobiology,WestChinaSchoolofPreclinicalandForensicMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China Abstract: Objective ToexpressandpurifyHapproteinofnontypeable Haemophilusinfluenzae (NTHi) inprokaryotic system,andstudyitsimmunogenicityandadhesiveactivity. MethodHapproteinwasexpressedin E.coliBL21withpET32a (+)-Hap and purifiedbyaffinitychromatography. TheadhesiveactivityoftherecombinantHap proteinwasobserved in competitive adhesion assay using scanning electron microscope and bacterial counting. BALB/C mice were immunized intranasallywiththepurifiedrecombinantHapproteinandcholeratoxinBsubunit (CT-B), andanti-HapIgAandIgGwere detectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay. Results SDSanalysisshowedasinglebandofthetargetprotein, whosepurityreached85%accordingtotheresultofGelanalysissoftware. Theconcentrationoftheproteinwas3.2g/Lafter ultra