光动力学诊断和荧光寿命成像显微学技术-2013.pptx

光动力学诊断（PDT) 荧光寿命成像显微学技术(FLIM)固体超荧光;基本概念 光动力学诊断的光物理机制 双光子吸收截面实验测量方法概述;光动力学诊断（Photodynamic Therapy，PDT）用特征波长光照射吸附有光敏药物的靶向肿瘤点，光敏药物产生三线态的氧，利用非自由基氧化过程杀死癌症细胞的诊断方法。最初使用是在1907年。（1） PDT 是一个冷光化学过程。光敏药物有低生物毒性，对器官损坏小，在处理某些恶性和良性的肿瘤有很大优势。（2）图1： PDT 的示意图; 根据鸿特规则，三线态能级比相应的单线态能量低;5;分子吸收和发射能量转移示意图;荧光：当物质分子吸收了特征频率的光子，由基态能级跃迁至电子激发态的各个不同振动能级。激发态分子经与周围分子撞击而消耗了部分能量，迅速下降至第一电子激发态的最低振动能级，并停留约10－9秒之后，直接以光的形式释放出多余的能量，下降至电子基态的各个不同振动能级，此时所发射的光即是荧光。;产生荧光的第一个必要条件是：该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构； 第二个条件是：该分子必须具有一定程度的荧光效率，即荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。;大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所以大多数分子在基态时处于单线态。 当分子受光照射时，若光子能量恰好等于分子的某两个能级的能量之差，则分子吸收光子并从基态跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能级。但其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单线态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转，生成三线态。 电子由S0进入T1的可能过程（ S0 → T1禁阻跃迁）： S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 ; E= Ee + Ev + Er; ?? 当一束频率为?强度为I0的电磁波照射到某物质或某溶液时，组成该物质的分子、原子或离子等粒子与光子作用，光子的能量发生转移 ，I0? = Ia + It + Ir???使这些粒子由低能量轨道跃迁到高能量轨道，即由基态转变为激发态。 ;分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图;不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光子的 能量也不同，即吸收波长不同。 用紫外可见近红外光谱方法、荧光光谱方法研究伴随有振动和转动能级的电子能级差特征。 红外光谱方法和拉曼光谱方法研究振动和转动能级差特征; ;光动力学诊断PDT过程能量转移示意图; 光动力学诊断过程;图（2）PDT对癌症作用机理示意图;二、光动力学诊断的光物理机制;波长选择:;（1）红外光较可见光有较少散射，能渗透到深的组织内部 （2）高的空间选择性，根据非线性吸收特点，光敏剂只有在高光子密度处的透镜聚焦的焦点处才有强的吸收 （3）红外光能量低，对细胞的损伤小 （4）活成具有大的吸收横切面且具有双光子活化特性的光敏剂是一个挑战。;双光子吸收基本原理;超短脉冲在非线性介质中的传播方程;双光子吸收的三阶非线性耦合波方程;光敏剂必须满足的条件：;围绕光敏剂开展的研究;双光子吸收截面及其测量;三、双光子吸收截面实验测量方法概述;双光子诱导荧光法; 在实际测量中，通常近似认为单光子荧光和双光子吸收诱导荧光的量子产率相同，因此，通过测量待测物和参考物溶液的单光子荧光量子产率，并在相同的实验装置下，测量溶液的双光子诱导荧光信号强度。;双光子诱导荧光法实验光路;非线性透过率测试方法;;对于均匀有机溶液样品，通过实验测试透射光强随入射光强的改变，拟合实验数据，可以得出样品的双光子吸收系数β。 分子的双光子吸收截面σ与双光子吸收系数的关系为：;注意： （1）避免所测样品或者实验元件中对入射光产生的一些反射，折射。 （2）样品中的其他非线性效应对透射光强的影响也会使测量结果有失准确。;瞬态激发态吸收光谱方法（一）;双光子吸收截面可以通过下式计算;将激光器出射的激光分成能量比为 1:1 的两束，其中一束作为泵浦光聚焦于样品中；另一束经过可调节的光延迟后再聚焦于合适介质（宝石片），产生超连续白光。将超连续白光分成能量比为1:1的两束，分别用作探测光和参考光。探测光也聚焦于样品中并在聚焦区完全被泵浦光覆盖。参考光进入盛有相同样品的参考池。从样品池和参考池透射出来的探测光和参考光聚焦于同一多色仪狭逢的不同点，利用CCD (Charge Coupled Devices) 记录多色仪输出的探测光和参考光的光谱。通过计算探测光相对于参考光的光强变化，可以获得样品的瞬态吸收谱。;Z－扫描方法;Z－扫描方法实验光路：;例子;荧光上转换的过程是一个三阶非线性过程，在这里通过双光子吸收完成。;荧光寿命成像显微技术;荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到单