3DNA的粗提取与鉴定.ppt

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专题3 DNA的粗提取与鉴定 一、基础知识 (一)提取DNA的方法 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法,分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2.提取DNA的基本思路 提取DNA,去除其他成分 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等 在物理和化学性质方面的差异 ⑴ DNA的溶解性 DNA和蛋白质等成分 在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 利用这一特点, 选择适当的盐浓度 就能使DNA充分溶解, 而使杂质沉淀; 或者让其他成分溶解, DNA析出 3.DNA等大分子的理化性质 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 DNA不溶于酒精溶液, 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步分离。 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质, 对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60~80℃ 而DNA在80℃以上才会变性 ③ 洗涤剂——溶解细胞膜,去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响 试剂: (二)DNA的鉴定 条件: 二苯胺 沸水浴条件下, DNA遇二苯胺被染成蓝色 沸水浴 现象: (一)实验材料的选取 (二)破碎细胞,获取含DNA的滤液 (三)除去滤液中的杂质(纯化) (四) DNA的析出与鉴定 二、实验设计 (一)实验材料的选取 从下列材料中选取2~3种 原则: 菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜; 鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞; 在液体培养基中培养的大肠杆菌 选用DNA含量相对较高的组织 (二)破碎细胞,获取含DNA的滤液 1、动物细胞 2、植物细胞 ——容易破碎 ——需要溶解细胞膜 鸡血细胞溶液: 加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌, 过滤后收集滤液 想一想:为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂? 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体, 水分大量进入血细胞,使血细胞胀裂; 加上搅拌作用,加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂, 从而释放出DNA ① 加入一定的洗涤剂和食盐 ② 充分的搅拌和研磨,过滤后收集研磨液 想一想:洗涤剂和食盐的作用分别是什么? 洗涤剂——离子去污剂,能溶解细胞膜,利于DNA释放 食 盐——NaCl,利于DNA的溶解于研磨液中 经研磨可破碎细胞壁,使细胞核内的DNA释放。若研磨不充分,会使提取的DNA量变少,导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论:滤液/研磨液中可能含有哪些成分? 答:可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质 想一想:研磨的目的是什么,如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响? 方法步骤 加入物质 目的 1 . 制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 ① 2 . 提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1 蒸馏水 ②幻灯片 18 3 . 溶解细胞核内的 DNA 2 mo1 / L 的 NaCI 溶液 40 mL ③幻灯片 18 4 . 析出含 DNA 的黏稠物 蒸馏水 ④ 5 . 滤取含 DNA 的黏稠物 ⑤ 6 . 将 DNA 的黏稠物再溶解 2 mol / L 的 NaCl 溶液 20 mL ⑥ 7 . 过滤含 DNA 的 NaC l 溶液 ⑦ 8 . 提取含有杂质较少的 DNA 冷却的 95 %的酒精 50 mL ⑧幻灯片 18 A : (1) 向试管中加入2mol/L的NaCl溶液5mL (2) 加入 DNA (3)4 mL 二苯胺试剂 9 . DNA 的鉴定 B : (1) (2)4 m L 二苯胺试剂 ⑨ ⑷ 混匀后,置于沸水浴中加热5min 向试管中加入2mol/L的NaCl溶液5mL ⑷ 混匀后,置于沸水浴中加热5min 1. DNA的溶解性 2. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 (三)除去滤液中的杂质 讨论:方案二与方案三的原理有什么不同? 方案二:利用蛋白酶分解杂质蛋白,使提取的DNA 与蛋白质分开; 方案三:利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同, 使蛋白质变性,与DNA分离 (四) DNA的析出与鉴定 与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95%), 静置2-3min,溶液中会出现白色丝状物 ——粗提取DNA 用玻璃棒沿一个方向搅拌, 卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水 1、DNA的析出 2. DNA的鉴定 ⑴ 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml ⑵ 其中一支试管中加入DNA丝状

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