BCA法测蛋白课件.ppt

实验二 BCA法测定蛋白质浓度(BCA protein concentration determination ) 耿 磊 生物化学教研室 （301室） 邮箱：sypgl@126.com 前 言 （一）、蛋白质的胶体性质 （二）、蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基 侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电 荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子 的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点。 （三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚 * 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破 坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其 理化性质改变和生物活性的丧失。 * 蛋白质沉淀（precipitation） 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互 缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉 淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此 凝块不易再溶于强酸和强碱中。 （四）、蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 （五）、蛋白质的呈色反应 (一）紫外吸收法 （四)考马斯亮蓝结合法 考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下能与蛋白质结合， 使染料的最大吸收峰值从465nm变成595nm，溶液的颜色 由棕红色变为蓝色，在595nm测定的吸光度值与蛋白质浓 度成正比，故可用于蛋白质定量测定。 优点：简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法 灵敏4倍）。 缺点：用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；大量去垢 剂会使显色反应受到干扰；标准曲线有轻微的非线性；比色 杯染色严重，影响重复性。 蛋白质是机体内主要的含氮物质，而且氮元素的含量相 当恒定，一般为16%，其他非蛋白质的含氮化合物所占得氮 量甚微。因此，测定生物样品的含氮量，即可推算蛋白质含 量。 优点：准确度高，可测定不同形态样品。 缺点：灵敏度低，适用于0.2～1.0mg氮，误差为±2％费 时。 （六）BCA法 BCA蛋白质检测流程： 实验目的 1.学习 掌握BCA法测定蛋白质浓度的 原理。 2.掌握721型分光光度计的使用。 3.了解蛋白质测定的多种方法，并比较其优缺点。 实验原理 原理图： 1、将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。 2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量，再计算出待测血清中蛋白质浓度（g/L)。 注意事项 1、紫外分光光度计的正确使用。 2、试剂的准确量取，按操作表的顺序依次添加试剂。 3、待测样品浓度在50～2000微克／毫升浓度范围内有较好的线性关系。 4、注意安全，保护好仪器。 1、试比较BCA法与双缩脲、Lowry法的异同。 2、BCA法常用于科研，其有哪些特点。 紫外分光光度计的使用 1）预热仪器。 2）选定波长。 3）固定灵敏度档。一般测量固定在“1”档。 4）调节“0”点。 5）调节T=100％。 6）测定。 7）关机。 下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 预习要点： 1、复习蛋白质两性解离。 2、预习电泳的基本原理。 3、结合几种蛋白质的等电点，为什么将点样端置 于阴极？ 4、为什么跑在最前面是清蛋白？而跑在最后面是 r-球蛋白？ 5、如何辨认各条带？ 6、请简要写出操作流程图。 7、请写出计算公式。 * * 内容 注意事项 前 言 实验目的 实验原理 思 考 实验步骤 前言 一、蛋白质的理化性质 ？ （一）、蛋白质的胶体性质 （二）、蛋白质的两性电离和等电点 （三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚 （四）、蛋白质的紫外吸收 （五）、蛋白质的呈色反应 前言 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之