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第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 内容 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 RNA提取的通用方法 　异硫氰酸胍/苯酚法 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；在酸性至中性条件下，DNA和蛋白质一起变性通过离心去除，RNA仍留在上清液中，最后用异丙醇沉淀。 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 RNA提取的通用方法 　异硫氰酸胍/苯酚法 步骤: 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。 RNA提取的通用方法 RNA提取实例------大豆总RNA的提取 1) 配制提取液 异硫氰酸胍(4mol/l) 4ml 苯酚 3ml 醋酸钠(2mol/l PH4.8) 0.3ml 氯仿 0.6ml PVP 0.04g 2) 将研钵放在-80℃冰箱中预冷，取1.2g花生豆授粉后30天的未成熟种子放入研钵中，加入液氮，迅速将花生豆研磨成粉末状，转移至提取液中，混匀，冰浴30min。 3) 4℃，8000rpm,离心13min。 4) 取上清，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），4℃，12000rpm,离心5min. RNA提取的通用方法 5) 取上清，加入0.5体积的3mol/l KAc(PH4.8),混匀，冰浴30min, 4℃，13000rpm,离心15min. 6) 取上清，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置1h, 4℃，8000rpm,离心13min。 7) 弃上清，在沉淀中加入1ml 4mol/LLicl,使溶解，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴2h, 4℃，13000rpm, 离心15min. 8) 弃上清，在沉淀中加入400uldH2O（经DEPC处理），再加入400ul氯仿，混匀，4℃，13000rpm, 离心6min. 9) 取上清，加入0.1体积的3mol/l NaAc(PH5.0),2倍体积无水乙醇，-20℃放置，30min，4℃，13000rpm,离心13min. 10) 弃上清，将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次，室温下干燥（70%乙醇用DEPC处理水配制） 11) 加入100ul dH2O（经DEPC处理）溶解，-20℃保存。 RNA提取的通用方法 影响RNA提取的因素 材料： 新鲜，切忌使用反复冻融的材料 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存 如要多次提取，请分成多份保存 液氮长期保存，－70℃短期保存 影响RNA提取的因素 影响RNA提取的因素 样品破碎及裂解： 根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻 样品量适当，保证充分裂解 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量 影响RNA提取的因素 纯化： 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； 经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解； 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。 影响RNA提取的因素 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 内容 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT