宏基因组功能基因筛选.pptx

宏基因组功能基因的筛选;目 录;宏基因组（Metagenome）;Metagenome VS Genome;目 录;Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA;16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对应的DNA序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为1500 bp 通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细菌的分类和进化分析。 ; Ashelford 等（2005）通过对4383个细菌16S rDNA的序列进行比对分析，表明16S rDNA 全长序列中包含9个可变区（V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲缘关系，可变区则表明物种间的差异。 Chakravorty 等（2007）总结16S rDNA 的序列，及其中九个9个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60 bp）和V6区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。 ;;真菌ITS的高通量测序分析;ITS 1 和ITS 2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异比较明显。IT S 的序列分析能实质性地反映出属间、 种间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS 序列片段较小、 易于分析, 目前已被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。;宏基因组文库 Metagenomic Library;基于宏基因组分离筛选功能基因的四个技术要素;环境样品DNA制备;载体;宿 主;序列驱动筛选 基于DNA序列水平的筛选。根据某些已知的相关功能基因的保守序列或相似序列设计杂交探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆子。 此方法的优点是可能筛选获得某一类结构或功能的蛋白质中的新分子，且能利用基因芯片技术大大提高筛选效率，缺点是必须对相关基因序列有一定的预先了解，较难发现全新的活性物质及其功能编码基因。 ;功能驱动筛选 生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子，结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。 如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大，效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。;SIGEX（Substrate-induced gene-expression screening），即底物诱导基因筛选，其基本原理为：代谢相关基因通常由相应的化合物（如底物或者代谢）诱导表达。因此，通过建立特定的宏基因组文库，利用流式细胞仪，筛选受一定底物诱导、与载体中的特定标签（如GFP）共表达的克隆子，就能够筛选到相应的代谢基因。 利用特殊载体，建立宏基因组文库，通过流式细胞术，实现功能基因的高通量筛选;SIGEX载体特点;Yun and Ryu，Microbial Cell Factories，2005;优点 能够筛选到新的代谢相关基因 诱导底物不需要经过特殊修饰 避免了引入酶切位点的麻烦和切断目的基因的可能 结合流式细胞术，适于高通量克隆和筛选 缺点 不能筛选组成型表达的基因 仅针对能进入细胞质的底物 仅适用于插入片段带有自身启动子的情况 出发菌株须与宿主菌株近缘 T载体容量有限，10kb的基因或操纵子难以克隆 与GFP反向插入的目的基因将漏检 目的基因与GFP之间有转录终止子的情况将漏检 ;三种筛选方法的比较;目 录;宏基因组测序;高通量克隆ORF ——The Gateway? system;Matsuyama and Yoshida，2009;不需要传统的酶切、连接方法 利用位点特异性重组，省时省力,可以实现高通量克隆 利用了ccdB选择方法，以确保高效率的分离重组克隆, 典型的效率是95% 在目的基因（或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway? 入 门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体， 创建各种各种各样的表达克隆;The Gateway? system 克隆ORFeome;得到生物体的ORFeome后，通过高通量诱导ORF 表达，利用“功能驱动筛选”，筛选得到相应的功能基因;谢谢！