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第四章 天然酶的纯化与制备 天然酶制备的基本步骤 天然酶的制备一般包括三个基本步骤: 酶的提取 酶的分离纯化 酶的结晶或制剂 第一节 天然酶的一般制备方法 酶的分离纯化是酶学研究的基础。 研究酶的性质、作用、反应动力学、结构与功能关系、阐明代谢途径,作为工具酶等都需要高度纯化的酶制剂。 如基因工程中所使用的各种工具酶都有高纯度的要求,内切酶中不能含有外切酶,反之一样,否则结果无法判断。 一、酶的提取 酶的提取是指在一定条件下,用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称作酶的抽提。 一、酶的提取 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。大多数酶能溶解于水,可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取;有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活,在提取过程中,要注意控制好温度、pH值等各种条件。 酶提取的主要方法 根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同,酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。 二、酶的分离纯化方法 酶的化学本质是蛋白质,所以用于蛋白质的分离纯化方法一般适用于酶的分离纯化。此外.酶是具有催化功能的蛋白质,因此根据酶与底物、底物结构类似物、辅助因子、抑制剂等的特异亲和力.可发展酶独特的亲和层析技术。所有的分离纯化方法,都是根据被分离物质间的物理、化学和生物学性质的差异而设计出来的。 盐析法 一般蛋白质在低离子强度介质中表现为盐溶(salted in)、而在高离子强度介质中表现为盐析(salted out),但不同的蛋白质盐析所需的离子强度不同。盐析法就是建立在此原理的—种简便有效的分离方法。 盐析法 硫酸铵是最常用的盐,因其在水中溶解度大,且受温度影响小,对酶不仅无害处。而且还起稳定作用.分级效果较好且价廉易得。可采用:a.加固体粉末盐;b.加饱和盐溶液;c. 对浓盐溶液进行透析等方式。一般对于大体积样品采用a,对于小体积样品采用b或c。通常层析洗脱液蛋白质浓度低,采用c方式沉淀蛋白质很方便。 有机溶剂沉淀法 随着有机溶剂的加入,介质的介电常数下降,使蛋白质分子间静电作用力增强;同时有机溶剂还可降低蛋白质分子表面的水合程度,从而导致蛋白质溶解度下降.直至最后沉淀下来。 有机溶剂沉淀法 最常使用的有机溶剂是乙醇、丙酮等。由于有机溶剂能使酶变性,一般应在低温下操作。同时宜加入适量中性盐,可增加蛋白质溶解度.降低变性作用,并提高分级效果。使用有机溶剂沉淀酶有两种方式:其一,如上所述,用乙醇或丙酮分级沉淀目的酶。其二,若目的酶在有机溶剂中稳定性强,可采用变性杂蛋白方式,使酶得到初步纯化。 等电点沉淀法 当介质的pH值与某蛋白质的等电点(pI)相等.该蛋白质分子间的排斥力最小.其溶解度亦最小,易于沉淀。因此可通过调节介质pH值.把目的酶与杂蛋白分开。此种沉淀法亦受介质离子强度等因素的影响。由于蛋白质在pI附近一定范围的pH值下都可发生沉淀,只是沉淀的程度很不一样,再者相当多的蛋白质pI点很靠近,所以该法的分级效果和回收率均不理想.一般只用在酶的粗分离阶段。 凝胶过滤层析 它又称凝胶过滤、分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻层析。它是依据分子筛效应,按分子的大小和形状来分离样品。因此它也可用于蛋白质分子量的测定。此法具有条件温和,操作简便,层析柱可反复使用.无需再生处理等优点。 离子交换层析 蛋白质是两性电解质。不同蛋白质出于其pI不同,在同一种pH值介质中电离状况会不同,分子所带电荷的种类和数量就不同.与离于交换剂的静电吸附能力亦不同。通过上样吸附和改变离子强度或pH值解吸洗脱、可使蛋白质依据其静电吸附能力由弱到强的顺序而分离开来。这就是离子交换层析法。它是一个重要而广泛应用的方法。 亲和层析 亲和层析就是将配体共价连接到基质上,用此种基质填充成层析柱,利用配体与对应的生物大分子(目的物)的专一亲和力,将目的物与其它杂质分离开。这一方法不仅可用于分离生物大分子,也可用于分离诸如病毒、细胞器、细胞之类的超分子结构。其操作与离子交换层析类似。 吸附层析 吸附层析是以吸附剂为固定相.以缓冲溶液或有机溶剂为流动相的一种层析方法。可用的吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、高岭土、纤维素、活性炭等。这些都是蛋白质层析的经典材料。应选择吸咐选择性好、稳定性强、表面积大、颗粒均匀、成本低廉的吸附剂。 电泳法 电泳是带电物质在直流电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象 由于蛋白质分子表面电荷的差异,应用电泳方法可将不同的蛋白质分子分离开来。 电泳法不仅可用于酶的
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