原核表达系统.ppt

基因原核表达系统 蛋白质溶解方式调节 与溶解性高的蛋白质序列融合 如GST、Trx（硫氧还蛋白 ）、NusA 与催化二硫键形成的酶融合 如Trx、DsbA、DsbC 与信号肽融合 DsbA、DsbC 低温培养、诱导 原核表达宿主菌的选择 BL21（DE3）：为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。 命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。 Rosetta （DE3）： Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 * * 转录载体 翻译载体 LIC （连接非依赖的克隆） 图3.5 SCMRP基因原核表达 M：蛋白质分子量标准；泳道1：IPTG诱导BL21(DE3 pET-32b)总蛋白；泳道2~4：IPTG诱导BL21(DE3 pET-32bS)总蛋白。 Fig. 3.5 Prokaryotic expression of gene SCMRP M: Protein Molecular Weight Marker; lane1: the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32b) induced by IPTG; lane 2~4: the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32bS) induced by IPTG. 图3.6 SCMRP融合蛋白大肠杆菌中表达的SDS电泳图 M：蛋白质分子量标准；1、4、7泳道分别是IPTG诱导pET32b表达2、4、6小时的DE3的总蛋白；2、5、8泳道分别是IPTG诱导重组质粒pET32bS表达2、4、6小时的DE3的总蛋白；3、6、9泳道分别是无IPTG诱导时，重组质粒pET32bS表达2、4、6小时的DE3的总蛋白。 Fig.3.6 SDSresult of SCMRP recombinant protein in E. coli strain DE3. The results showed the fused proteins are expressed in E. coli by IPTG induction. The fused protein has a molecular mass of about 20KD. The samples were collected 2h, 4h, 6h after induction by IPTG from pET32b (lane1,4,7) and from pET32b-SCMRP (lane2,5,8), respectively. The samples were collected 2h, 4h, 6h from pET32b-SCMRP (lane3,6,9), respectively. M：Protein Molecular Weight Marker. 图3.7 SCMRP基因原核表达产物溶解形式分析 M：蛋白质分子量标准；泳道1、2：BL21(DE3 pET-32bS)表达蛋白质的可溶组分；泳道3：BL21(DE3 pET-32b)表达蛋白质的可溶组分；泳道5、6、7：BL21(DE3 pET-32bS)表达蛋白质的不溶组分；泳道8：BL21(DE3 pET-32b)表达蛋白质的不溶组分。 Fig. 3.7 The dissolvability analysis of prokaryotic expression product of the gene SCMRP M: protein marker; lane1-2: dissolvable group of fusion protein by BL21(DE3 pET-32bS); lane3: dissolvable group of fusion protein by BL21(DE3 pET-32b); lane5-7: insolvable group of fusion protein by BL21(DE3 pET-32bS); lane8: insolv