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实验 7 动物染色体的制备 --牛蛙骨髓细胞染色体标本的制备、观察 一、实验目的 1.了解制备中期染色体标本的原理。 2.熟悉并初步掌握制备骨髓染色体的操作方法。 * * 染色体是生物遗传基因的载体。在物种进化、作物育种、性别鉴定、基因定位以及癌症和遗传性疾病的诊断中,有时需要制备染色体标本。动物的骨髓中存在大量活跃的进行有丝分裂的细胞,是染色体制备的理想材料。给动物注射了特异作用于微管系统的秋水仙素后,可以抑制纺锤体的形成,使分裂细胞阻断于有丝分裂中期。收集骨髓细胞,低渗处理,使细胞质膜破裂,以利染色体的分散。细胞经固定后,于预冷的载玻片上滴片,使染色体散开,再用姬姆萨染色,便可以制成染色体标本。 * * 二、实验原理 * * 人外周血淋巴细胞染色体(Giemse 染色) * * * * 三、实验用品 试剂:0.65%生理盐水,甲醇—冰醋酸(3:1)固定液, 蒸馏水,Giemsa染液。 器材:显微镜,离心机,搪瓷盘,剪刀,骨剪,离心管,注射器,染色缸。 材料:肉用成体牛蛙 * * 动物的药物处理(课前已经完成) 牛蛙称重,按每克体重2 μg的剂量腹腔注射秋水仙碱溶液(用0.65%生理盐水配制)。注射后3.5-4小时,双毁髓法处死牛蛙。 * * 四、实验步骤 1.每组同学取前肢、后肢各一,取出肱骨、股骨和胫腓骨等长骨。剪去骨两端膨大部的半透明软骨,程度以刚刚露出骨髓组织为宜。每组保证有1根后肢长骨,或者2根前肢长骨。 2.在小烧杯中加入3 ml的0.65%生理盐水,取带针头的注射器,吸入1 ml 0.65%生理盐水,将针头沿骨的长轴方向从骨的一端刺入骨中,缓慢推动注射器活塞,将骨髓细胞冲洗到10ml离心管中。注意:冲洗时动作要徐缓,以免溶液喷出,损失骨髓细胞。此3ml的生理盐水要反复使用,直到把所有材料中的骨髓冲出为止。将骨髓冲出物中大块白色脂肪组织用针头挑出弃去。 * * 四、实验步骤 * * 四、实验步骤 取后肢:剪开牛蛙后肢与躯干接合部的肌肉,可看到膨大的关节部。 * * 四、实验步骤 取后肢2:用剪刀顺着关节外围剪开。 * * 四、实验步骤 取后肢3:剪开后的后腿关节。 * * 四、实验步骤 取前肢1:找到关节所在。 * * 四、实验步骤 取前肢2:剪开肌肉,顺着关节外围剪开。 * * 四、实验步骤 * * 四、实验步骤 3.在载玻片上滴1滴蒸馏水,然后滴加2滴第2步获得的骨髓细胞悬液。轻轻晃动载玻片,使液体混匀,并在载玻片上铺展开。18-20℃下静置,低渗处理20-30分钟。注意防止水分蒸发。 4.在培养皿中放入两根竹签,将滴有骨髓细胞的载玻片放在竹签上,缓慢向培养皿中加入固定液I(无水乙醇:冰醋酸:蒸馏水=1:2:3)室温下利用挥发的蒸汽固定100-120min。 5.吸走固定液,换入无水乙醇,蒸汽固定10-20分钟。 6.取出载玻片,缓缓倒去低渗液,用吸管将固定液II(无水乙醇:冰醋酸=1:2)自载玻片的一端缓慢滴下形成水幕,固定3-4次,直立载玻片空气干燥。 注意,每组做2片 45° * * 蒸汽固定法 四、实验步骤 7.在干净的培养皿中放入两垛盖玻片(每垛3片),将固定并充分干燥的载玻片有细胞的一面向下,放置于盖玻片上,将Giemsa染料用吸管注入载玻片和培养皿底的间隙中,扣染20-30分钟。 8.用蒸馏水稍洗使脱去浮色,吸水纸吸干载玻片底面和周围的水分,空气干燥后在显微镜下观察。不使用油镜的情况下不需要盖玻片。 Giemsa染色 改良苯酚品红染色 * * 蒸汽固定法 四、实验步骤 注意事项 1.骨髓染色体标本的制备成败决定于取材,若抽取的骨髓太少或太稀,细胞数目过少,不易获得较多的中期分裂相。 2.低渗处理极为重要,低渗不够,则染色体聚在一起,分散不好。太过,则造成细胞破碎,染色体丢失。 * * 五、实验结果 1.找出最好的几个分裂相,数出染色体条数. 2. 画出两个好的分裂相的显微图。画图里用铅笔,对照着显微镜视野来画,不要画“想象图”。 3. 取骨髓前,为什么要给牛蛙注射秋水仙素? * * 牛蛙染色体,2n = 26 五、实验结果 * *
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