实验八细胞内溶酶体和线粒体的荧光标记.ppt

细胞内溶酶体和线粒体的荧光活体染色 实验原理 ?Mito-Tracker Green是一种线粒体(mitochondria)绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色。??Mito-Tracker?Green为采用Molecular?Probes公司的carbocyanine进行了荧光标记的一种Mito-Tracker，分子量为671.88，可以用作线粒体特异性的荧光探针。和rhodamine?123或JC-1相比，Mito-Tracker Green对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。 实验原理 Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。????Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral?Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。 1.实验目的 掌握荧光显微镜工作的原理 了解细胞器在细胞内的分布 了解荧光染料的使用方法 Lyso-Tracker Red工作液的配制： a. 取少量Lyso-Tracker Red按照1:13333-1:20000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使 最终浓度为50-75nM。例如取1μl Lyso-Tracker Red加入到20ml或13.33ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的 HBSS)中。 2. 溶酶体的荧光标记： a. 去除细胞培养液，加入步骤1配制好的并28℃预温育的Lyso-Tracker Red染色工作液，与细胞28℃共孵育30分钟。 b. 去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入500微升预温的新鲜的细胞培养液或PBS漂洗。 c. 取出盖玻片，在载玻片上滴一滴PBS，将盖玻片反扣在载玻片上，荧光观察 d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到溶酶体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Lyso-Tracker Red染色工作液中Lyso-Tracker Red的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。 使用说明： 1. Mito-Tracker Green储存液的配制： 用无水DMSO(anhydrous dimethylsulfoxide)配制Mito-Tracker Green至终浓度为1mM。配制后可以-20℃或更低温度避光保 存。 2. Mito-Tracker Green工作液的配制： a. 取少量1mM Mito-Tracker Green储存液按照1:5000-1:50000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的 HBSS)中，使最终浓度为20-200nM。例如取1μl Mito-Tracker Green加入到50ml或5ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。混匀后即为Mito-Tracker Green工作液。HBSS with Ca2+ Mg2+ (C0219) 可以向碧云天订购。 b. Mito-Tracker Green工作液使用前需28℃预温育。 注：工作液中Mito-Tracker Green的浓度可以根据实际情况进行适当调整。为降低背景，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的Mito-Tracker Green。 3. 线粒体的荧光标记： a. 去除细胞培养液，加入步骤2配制好的并28℃预温育的Mito-Tracker Green染色工作液，与细胞28℃共孵育15-45分 钟。 b. 去除Mito-Tracker Green染色工作液，加入500微升28℃预温育的新鲜细胞培养液或PBS漂洗。 c. 取出盖玻片，在载玻片上滴一滴PBS，将盖玻片反扣在载玻片上，荧光观察。 d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker Green染色工作液中Mito-Tracker Green的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。 1 打开可将光和激发光光源（预热10分钟） 2遮光板遮住激发光 3 选择“1”，在可见光下，聚焦，观察清晰图像，再调到高倍镜下，微调至清晰 4 关掉可见光光源，打开遮光板，让激发光透过 5 选择“G”观察红色荧光 6 选择“B”观察绿色荧光