常用中药的生物鉴定-PCR.ppt

常用中药的生物鉴定 之聚合酶链式反应 常用中药的生物鉴定方法 免疫鉴定法 电泳鉴定法 生物效价鉴定法 单纯指标鉴定法 细胞生物学鉴定法 DNA遗传标记鉴定法 mRNA差异显示鉴定法 原 理 乌梢蛇高特异性PCR鉴别引物的设计 从GenBank下载正品原动物乌梢蛇及混伪品线粒体12S rRNA基因序列 经DNAMAN软件对位排列分析正、混品间DNA序列差异，设计出一对能特异性扩增乌梢蛇12S rRNA基因片段的特异性鉴别引物HWL-1和HWH-1 （上海生工生物合成公司） 模板DNA的提取 基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。 特异性PCR鉴别 反应体系： Tris-HCl 10mmol/L 氯化钾 50mmol/L Mg2+ 1.5mmol/L dNTP 0.15μmol/L Taq 1U(40ml) 引物 0.15μmol/L 模板DNA 50ng 琼脂糖凝胶电泳 取5μl反应液经1.8%琼脂糖凝胶电泳 EB染色 紫外凝胶分析检测 成像 结 果 模板质量研究 （1234为正品） 高特异性PCR鉴别的研究 个体差异的研究 炮制品特异性的研究 PCR在其他中药中领域的应用 中药材蛇胆的DNA分子标记鉴定研究-南京师范大学遗传资源研究所-王义权教授 中药材蛤蟆油PCR鉴定-王义权 鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究-王义权 Denaturation 变性。Annealing 退火。Extension 延伸。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 Buffer 缓冲。Primer[‘praim?] 引物，启蒙。Tube 管。Pipette 移液。 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)。 MgCI2维持DNA酶活性。 KCI促进引物褪火。 1.5 1.0 0.5 0.2 Kb 10 gamma primer Mismatch 3 base 10 gamma primer complete match PCR的应用 1.detection genetically modification organism (GMO )检测转基因生物，找出特异的基因或片段 find specific gene or fragment (promoter) 2.uncultured microorganism 3.pathogen identification 4.detection insertion sequence (cloning) 提取模板 反应体系配置 PCR扩增 电 泳 引物设计 乌梢蛇为《中国药典》(2010版)一部收载的一种常用中药，来源于游蛇科动物乌梢蛇[Zaocys dhumnades(Cantor)]的干燥体。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮。 商品流通中多以红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等来混作正品药材进行销售，这些品种多数与乌梢蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。 鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切，但商品来源复杂、药材性状鉴别困难的现状，为满足目前市场常见混伪品的鉴别要求，寻找经济实用、准确便捷、稳定性高的方法，应用高特异性PCR方法对乌梢蛇药材及其混淆品的原动物和炮制品进行鉴别。 高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品 功效：祛风、通络、止痉。 市售混淆品：红点锦蛇、黑眉锦蛇、 玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等 步骤 预变性 95°C 4 min 变性 95 °C 40 sec 褪火 65 °C 1min 延伸 72 °C 30sec 延伸 72 °C