酶联免疫斑点法研究进展.pdfVIP

维普资讯 中国优生与遗传杂志2006年第 14卷第11期 ·117· 酶联免疫斑点法研究进展 何 江，周 郁，仇东辉，余伍忠，刘 丽，桂俊豪，王 瑞 (兰州军区乌鲁木齐总医院临·床医学研究所，乌鲁木齐 830000) 中图分类号：11392．1 文献标识码：A 文章编号：1006—9534 (2006)11—0117—02 酶联免疫斑 点 (Enzyme—LinkedImmunoSpotassay． ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的 ELISpot)技术最初用于检测分泌抗原特异性抗体的个体 B 细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：(1)ELISA 细胞，以后该方法经过不断改进，用于检测分泌某一细胞因 通过显色反应后在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线 比较得 子或特定抗原的单个细胞。ELISpot方法操作简便、稳定，灵 出可溶性蛋白总量，而ELISpot通过显色反应可在细胞分泌 敏度高，可在单细胞水平进行细胞因子的监控，已经成为免 这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，直接在 疫学上的标竿技术。其可以模拟体内环境 ，跟踪细胞因子的 显微镜下人工计数斑点或通过ELISpot分析系统对斑点进行 产生，是检测细胞功能的独特手段 ，其现 已被广泛运用于疾 计数；(2)由于是单细胞水平检测，ELISpot比ELISA、有限稀 病诊断和科学研究活动之中。本文就ELISpot技术作如下综 释法和胞质内染色法等更灵敏，能从20万 一30万细胞中检 述。 出1个分泌该蛋白的细胞(图1所示)；(3)捕获抗体为高亲和 一 、 ELISpot的原理 力、高特异性、低 内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞 ELISpot是一种在细胞悬液中定量检测细胞因子生成细 时，不会影响活化细胞分泌细胞因子；(4)ELISpot分析使单细 胞的分析方法。该方法采用双抗体夹心ELISA法 ，即抗待测 胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感 ，因为它是在直接在 细胞因子的特异性捕获抗体预先包被在微孔板的PVDF膜 分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡 ，或者被临 上；将细胞及其刺激剂加到孑L中，微孑L板放在37％、CO，孵箱 近的细胞上的受体捕获，或降解之前。 内孵育一段时间，此时捕获抗体 (离分泌细胞很近)即与活化 细胞分泌的待测因子结合；洗掉未结合的细胞后，将生物素化 的特异性检测抗体加到孔中；洗掉未结合的检测抗体，加入碱 性磷酸酶标记的链亲和素；洗掉未结合的酶，加入底物溶液， 蓝黑色的沉淀即在细胞因子出现的位置形成斑点；每个斑点 代表单个分泌待测因子的细胞。斑点多少可以在 ELlSpot阅 读仪上进行 自动化计数或在显微镜下进行人工计数 图1 ELISpot法在检测低频率产生细胞因子的 二、技术优势和特点 细胞时具有独一无二的敏感性 ELISpot技术相对于ELISA和流式细胞仪等检测细胞内 (将指定数 目的能产生 IFN一的T细胞与一百万个 细胞因子的方法，可用于从外周血单个核细胞 (PBMC)、骨髓 抗原呈现 细胞 (AntigenPresentingCells，APC)混合 或中枢神经系统淋巴组织中的单细胞悬液中计数能分泌细 后 ，使用 ELISpot法(左 图)和 ELISA法(右 图)分别 胞因子的活化细胞 。其所具有的技术优势和特点主要表