有机溶剂分离多肽实验.doc

有机溶剂分离多肽实验 最终目的：筛选出有效的有机溶剂萃取方法，从裂解液中分离浓缩出Aβ多肽。 本次目的：1、测定不同种类的有机溶剂对Aβ多肽分离的影响； 2、测定不同浓度的有机溶剂对Aβ多肽分离的影响。 实验预计时间： 实验设计人： 实验人： 实验材料： 1、包涵体 2、有机溶剂（乙醇、丙酮、乙腈） 3、8M尿素（pH8.5）：12g尿素，加入TE 15ml，完全溶解后以TE定容至ml 4、1×TE（pH8.5）：（0.5M pH8. 5）Tris-Cl 100ml +（0.5M pH8.5）EDTA 10ml，ddH2O定容至1L 考染法测定蛋白质浓度材料 BSA标准品（0.05-0.30mg/ml）； 考马斯亮蓝G-250染液：考马斯亮蓝G-250 100mg，以50ml 95%乙醇溶解，加入100ml 85% 磷酸，以ddH2O混匀定容至1L，滤纸过滤； 电泳材料 4倍还原buffer； 分离胶浓度为16.5%的凝胶：按照表一和表二配制； 表一 16.5%分离胶配制表 49.5%T-3%C 3.0ml 3M pH8.45 Tris-Cl 、SDS 3.0ml 30%甘油 3.0ml 10%AP 54μl TEMED 9μl H2O 2.5ml 49.5%T-3%C 0.5ml 3M pH 8.45 Tris-Cl、SDS 1.5ml 10%AP 25μl TEMED 4.5μl ，30醇，ddH2O混匀定容至00ml； 脱色液：30ml甲醇，10乙酸，ddH2O混匀并定容至100ml50ml甲醇，10乙酸，用ddH2O定容至100ml的Aβ融合蛋白变性液裂解液的制备工艺， 包涵体变性：每10g包涵体加入50ml 8M尿素和2ml 0.5M DTT，混悬均匀，室温静置0.5-1h，在BECKMAN-J2型离心机上，9000-10000rpm，30min，15℃，离心后移出上清液（变性液C），并计量体积。取样用于检测蛋白质浓度和多肽纯度。 变性液浓度调整稀释比例（终浓度0.3-0.5mg/ml），一般按照10ml变性液加入120-190ml 20mM PB，混匀后室温静置8-18h。 有机溶剂分离多肽：按照一定比例（见表三）向200μl裂解液中加入有机溶剂，4℃静置一定时间（100μl 8M尿素复溶，上清以8M尿素补至100μl，取样，考染法测定蛋白质浓度和电泳检测多 浓度 裂解液 溶剂体积 总体积 沉淀复溶 上清 40% 200μl 133μl 333μl 100μl 100μl 2 50% 200μl 200μl 400μl 100μl 100μl 3 60% 200μl 300μl 500μl 100μl 100μl 4 70% 200μl 466μl 666μl 100μl 100μl 5 80% 200μl 800μl 1000μl 100μl 100μl 6 丙酮 40% 200μl 133μl 333μl 100μl 100μl 7 50% 200μl 200μl 400μl 100μl 100μl 8 60% 200μl 300μl 500μl 100μl 100μl 考染法测定蛋白质浓度： 检品处理，直接加样或用PBS稀释到合适浓度加样； 在96孔板上加入纯水或PBS（空白孔）、检品或处理后的检品，及对照品系列（0.05-0.30mg/ml），每孔10μl，每个样品平行3孔，再加入200μl考染试剂，室温静置10分钟； 用酶标仪测定OD570，将数据导入EXCEL中； 根据空白孔及对照品的测定值（平均值）与对应的浓度值，计算标准曲线（蛋白浓度与吸收值的关系图），然后再根据96孔板上检品的测定值（平均值）和标准曲线计算检品测定时蛋白浓度； 根据稀释倍数及④测定的结果计算检品的蛋白浓度。 SDS电泳检测多肽纯度： 按表一和表二配方制备分离胶和浓缩胶： 检品处理：取30μl样品于EP管中，加入10μl还原buffer，混匀，沸水浴10min。 上样：将胶板在电泳槽中装好，并将电极缓冲液注入电泳槽的前后槽，在加样孔中加入处理好的检品。 电泳：接通电源，16.5%的分离胶先用恒流40mA开始电泳，待溴酚兰进入分离胶后将电流调至80mA，直至溴酚兰至胶底部，电泳结束（如果是两块电泳板则电流加倍）。 固定：30min 染色：将电泳胶浸入染色液中，在摇床上染色1小时以上；或用微波炉进行快速染色。 将电泳胶从染色液中取出，浸入脱色液中，直至凝胶底色近于无色为止；或用微波炉进行快速脱色。 成像：凝胶成像系统。Aβ多肽对应条带的纯度。 以有机溶剂处理前的裂解液为对照，计算多肽量（望大）或多肽回收率（望大），当多肽量或多肽回收率无统计学差异时，以多肽纯度（望大）为第二