生物化学-蛋白质3.ppt

①电泳 SDS电泳示意图 ①电泳 等电聚焦在等电聚焦时，蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。 不同等电点的蛋白质分子在等电聚焦电泳结束后，会分别聚集于其等电点的位置，这样不同的蛋白质分子就得以分离。 ②离子交换层析 是用离子交换树脂作支持剂的一种层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物。 ②离子交换层析 R CH COOH NH3+ +M1A+ R CH COOH NH3M1 +A+ 氨基酸（在酸性溶液中） 阳离子交换剂 氨基酸盐 R CH COO－ NH2 +M2B － R CH COO M2 NH2 + B － 氨基酸（在碱性溶液中） 阴离子交换剂 氨基酸盐 M1为酸性基团，M2为碱性基团 （4）利用选择性吸附的纯化方法 吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同，达到使它们分离的目的。 硅胶、氧化铝、活性炭等物质为固体吸附剂，能够将其它分子吸附在表面。 吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和蛋白质的性质三个因素。 （5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法 原理：利用蛋白质分子能与其相对应的配体进行特异的、非共价的、可逆的结合来分离纯化，即亲和层析法。 配体：指能与某些蛋白质进行特异结合的化合物，如配体的作用物及抑制剂、激素和受体、抗原和抗体、酶及底物等。 （5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法 亲和色谱颗粒 三、蛋白质的定量检测 1．凯氏定氮法 2．紫外-分光光度计法 3．双缩脲法（Biuret法） 4．Folin-酚试剂法（Lowry法） 5．考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法） 6．BCA法 1．凯氏定氮法 原理：氮在蛋白质分子中含量恒定（平均占16%），因此测出样品中氮的含量后，即可求得样品中蛋白质含量。 每克样品中含氮的克数×6.25×100=100克样品中蛋白质的含量（克%）。 2．紫外-分光光度计法 由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，所以在280nm吸收值与浓度成正比，可用于蛋白质含量测定 蛋白质浓度mg/ml=1.45A280－0.74 A260 由于此法非常简便，条件要求低，因此常作为粗略定量蛋白质的方法来使用 。 3．双缩脲法（Biuret法） 包含肽键基团的化合物能与硫酸铜-氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物。 在540 nm处测定其吸光值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。 双缩脲法的测定范围为1~10 mg蛋白质。 优点是快速，缺点是灵敏度差。 4．Folin-酚试剂法（Lowry法） 又叫Lowry法 其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生双缩脲反应，然后蛋白质中的酚基（如酪氨酸）在碱性条件下很容易将混合试剂（含有磷钼酸和磷钨酸）还原或蓝色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在650~660nm下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。 此法比双缩脲法灵敏100倍。蛋白质测量范围在25~250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受还原剂、EDTA、Tritonx-100及酚的影响，并且蛋白质的种类不同，有较大的变动。 5．考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法） 用考马思亮兰G-250染色蛋白质，出现的颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。其颜色在595nm的光波下，有强烈吸收峰。 常用此反应来定量测定蛋白质含量。 6．BCA法 BCA法是对一价铜离子敏感、稳定和高特异性活性的试剂。 在碱性溶液中，蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子，一价铜离子与测定试剂中的BCA形成一个在562 nm处具有最大光吸收的紫色复合物，该复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。 因此，可用BCA法来测定蛋白质含量。 四、蛋白质的纯度分析 1．溶解度分析 2．电泳法 3．超离心沉降法 4．免疫学方法 5．分光光度法 6．化学分析法 1．溶解度分析 单一蛋白质的溶解度曲线不因加入过量的试样而改变。 如果蛋白质制品是纯的，直线的斜率为1，在折点以后，斜率为零。 不纯蛋白质的溶解度曲线常常呈现两个或两个以上的折点。 溶解的蛋白质量 加入的固体蛋白质的量 2．电泳法 “电泳法”只是一个相对的概念，因为在不同支持物上，电泳分离的效果不一样。 在纸上电泳为一条区带的样本，在聚丙烯酰胺凝胶泳时，可能分成数条区带；如结合等电聚集电泳则更可提高分辩力，很容易检出微量杂蛋白质的混存。 3．超离心沉降法 均一分子量的蛋白质其沉淀速度是一致的，因此离心后在溶剂中形成一条明显的分界线。 若为两种分子量不同的蛋白质混合时，则形成二条分界线。 4．免疫学方法 蛋白质往往具有抗原性，用琼脂免疫