内毒素讲稿精选.ppt

细菌内毒素及(1-3)-?-D-葡聚糖定量检测与临床评价 左大鹏 首都医科大学北京安贞医院感染科 内毒素的定义 英文称作Endotoxin ，是G-菌细胞壁上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖（LPS）中的类脂A。 (1-3)-?-D-葡聚糖定义 葡聚糖为真菌细胞壁结构成分之一，占其干重的80%-90%。其中1-3- ?-D-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状(1-3)-?-D-葡聚糖残基作为侧链。对于(1-3)-?-D-葡聚糖在深部真菌感染中的意义，与内毒素在G-阴性杆菌感染中的意义类似。 内毒素及(1-3)-?-D-Glucan定量检测在其他方面的应用 1、药品中污染热原质（内毒素及(1-3)-?-D-Glucan ）的检测。 2、医疗用具，一次性注射器，输血器，人工脏器等中的内毒素及(1-3)-?-D-Glucan检测。 动态比浊法： 采用光电转换原理，通过测定生物试剂与微生物细胞的特定结构反应产生的浊度/色度变化值，建立反应时间（T）和微生物含量（C）之间关系的标准曲线，从而定量测定样品中微生物的含量。 标准内毒素为CAPE COD研究所出品的大肠杆菌内毒素标准用蒸馏水制成100ng/ml的母液，4 ?C 储存备用。使用时，用蒸馏水作系列稀释测定，制作标准曲线。 血浆样品经特殊处理后去除抑制物质，与内毒素试剂混合后置37?C反应30min，在反应过程中内毒素试剂中的酶被从多肽上由内毒素切割下类的硝基苯受激活而发生连锁反应，硝基苯胺被水解成黄色的腈。为了避免血浆胆红素引起的误差，反应中添加亚硝酸钠和偶氯试剂，使反应完成并呈现红色，于450nm处测定吸光度，然后与标准曲线对比，计算出内毒素含量。 试剂与仪器 国外：血液（包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁等）中内毒素以及(1-3)-?-D-Glucan微量定量检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用细菌内毒素及(1-3)-?-D-Glucan检测仪器及配套的检测试剂盒，而且获得FDA及厚生省批准文号，作为一种日常检测项目。 日本和光纯药工业株式会社生产的 β–葡聚糖试剂盒有助于对深部真菌感染的诊断、治疗方法选择及疗效的判定。试剂盒特征：1、特异性测定（1-3）-β-D-葡聚糖2、单种试剂无需配制3、通过稀释加热法对标本进行预处理4、用比浊时间分析法能进行定量测定5、对深部真菌感染的早期诊断有用 国内：MB-80 检测系统，为国内独家研制和生产的检测临床内毒素及(1-3)-?-D-Glucan的专用仪器，同时具有配套的检测试剂盒 EKT-5Mset and GKT-%M set　获得SDA批准文号, 参考值 正常人血浆中内毒素水平一般在7pg/ml以下。 正常人血浆1-3-?-D-葡聚糖含量水平一般在10pg/ml以下。 真菌1-3-?-D-葡聚糖检测临床判断值： 10-20pg/ml：病变观察期 ?20pg/ml：深部真菌感染 标本采集和处理 1、标本采集 抗凝剂可用肝素。 专用的无菌及无致热源的采血管。 2、标本处理： 血液中内毒素除了游离状态存在外，还大量附着在血小板上。因此试验中要分离富含血小板血浆。可采用以下两种分离方法： （1）4?C、1000g、10min （2）常温、3000g、1min 分离过程中绝对避免细菌污染，如暂不检测可与-30 ?C冰冻保存1个月。 3、检测时间：60min 4、主要技术指标 （1）检测范围 内毒素：5-1000pg/ml 1-3- ?-D-Glucan：10-9000pg/ml （2）平均回收率：80%-125% （3）重现性：CV?10% 对MB-80微生物快速动态检测仪的性能评价 我们对金山川科技发展有限公司生产的MB-80微生物快速动态检测仪进行了初步的性能评价，评价包括重复性、准确度、线性范围和比对试验。结果如下： 1、取一份细菌性肺炎病人标本，重复测定10次，内毒素的CV值为5.3%。 2、取一份真菌性肺炎病人标本，重复测定10次，真菌葡聚糖的CV值为6.7%。 3、用公司提供的内毒素标准品，测定5次，取均值，然后计算相对误差为23.4%。 4、用公司提供的真菌葡聚糖标准品，测定5次，取均值然后计算相对误差为21.8%。 5、线性 （1）我们取内毒素的标准品，按照公司提供的检测范围，从1000pg/ml开始做5倍稀释，共稀释5次，进行检测，做直线回归分析，相关系数（r）为0.985。 （2）我们取真菌聚聚糖的标准品，按照公司提供