第05蛋白质化学合成与人工修饰.ppt

第五章 蛋白质的化学合成与人工修饰 Artificial synthesis and modification 本章的主要内容： 1. 蛋白质的化学合成方式与原理； 2. 蛋白质的人工修饰。 第一节 蛋白质的化学合成 主要内容： 1. 多肽或蛋白质化学合成的原理； 2. 合成方式； 3. 应用举例。 一、多肽和蛋白质的化学合成 （一）合成的原理 （二）多肽合成的方式 多肽合成分为液相和固相两种合成方法。 1.液相法：最早使用的多肽合成方法。 按照预定的氨基酸序列，在液相中完成全部缩合反应。特点：费时，效率极低，准确性差。 2.固相法：常用方法。 将肽链一端的氨基酸（通常为C端的-COOH）挂在一个不溶性的高分子载体上，与液相中的氨基酸逐一进行反应，直至将全部氨基酸合成，再将多肽从载体上分离下来。 特点：操作简便，准确性约100%，效率高，可规模化合成。 （三）应用举例：以胰岛素的人工合成为例。 1965年我国科学工作者完成了牛胰岛素的全合成。途径是：先分别合成A链21肽和B链30肽，再将A、B两条肽链经还原、氧化连接成牛胰岛素 A链合成：分别获得N端9肽和C端12肽，然后脱去12肽N端的保护基，与9肽以叠氮法缩合成带保护基的A链。 B链的合成：采取8＋22的途径。 在合成A、B链的基础上进行全合成并人工进行氧化还原，形成二硫键。得到了与天然牛胰岛素完全相同。这充分证明了合成的结晶产物就是胰岛素。 第二节 蛋白质的人工修饰 一、功能基团的特异性修饰 1. 多位点取代 1）常规的氨基保护：用取代基进行修饰。常用的取代基有两种：t-butyloxycarbonyl（丁基氧化羰基，Boc）和 Methane sulphonylethyloxycarbonyl（甲基硫代乙基氧化羰基，Msc）。 2）亚氨代乙酰基：修饰ε-氨基一种方法。当ε-氨基被亚氨代乙酰基取代时，α-氨基在很大程度上可不被修饰。 3）其他侧链的取代：羧基的甲基脂化；巯基的氧化（磺酸）和还原（DTT）。 2. 限制性取代 1）α-异硫氰酸苯脂对α-氨基的选择性 2）在C-末端产生的酶指导下的取代---蛋白质活性亲核成分的产生。 3）酶指导下的C-末端取代---蛋白醛的产生。 4）通过蛋白质水解的逆反应产生蛋白和肽的α-酰氨。 5）蛋白醛---由糖的化学氧化产生。 3. 次级取代 1）与蛋白醛偶联---亲核取代物。 2）与蛋白质活性亲核物偶联---醛取代物。 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 1. 嵌合蛋白质---非共价缔合系统 2. 二硫键与嵌合蛋白质的形成 3. 嵌合蛋白质---通过化学激活形成肽键 4. 嵌合蛋白质---通过酶连接反应形成肽键 1）从猪胰岛素生产人胰岛素（B30: Ala→Thr） 2）片段的缩合 3）通过酶法和活性酯偶联 5. 通过非肽键形成嵌合蛋白质 * * 二、胰岛素的人工合成 * 1965年我国科学工作者完成了牛胰岛素的全合成。他们合成牛胰岛素的主要途径是先分别合成A链21肽和B链30肽，再将A、B两条肽链经还原、氧化连接成牛胰岛素（图4－14）。 A链合成采取下列途径，先分别获得N端九肽和C端十二肽，然后脱去十二肽N端的保护基，与九肽以叠氮法缩合成带保护基的A链。 B链的合成采取8＋22的途径，为了避免大肽连接时发生消旋，特意在 B8、B20、B23的甘氨酸残基处分段，合成了以甘氨酸为羧端的肽段：B1~8、B17~20、B21~23。在不得不用其他氨基酸为C末端时，便尽量用叠氮法或者活化酯法接肽以保证光学纯度。 在合成A、B链的基础上进行全合成。带保护基的二十一肽和三十肽衍生物分别用Na－液NH3处理后，再用连四硫酸钠（sodium tetrathionate）和亚硫酸钠进行S－磺酸化，经初步纯化后得到二十一肽和三十肽的SSO3－衍生物。A链和B链接1.2：1.0的分子比混合，以摩尔的巯基乙酸还原，然后在空气中氧化。其产物用小白鼠惊厥法测定活力，为天然胰岛素的1.2％～2.5％。此粗制品经酸性仲丁醇提取两次后，纯度达到50％。产物在含锌离子的缓冲液中结晶。得到的人工合成牛胰岛素在结晶形状、电泳与层析行为、酶解图谱以及生物活性（降血糖性能与免疫性能）等方面与天然牛胰岛素完全