ELISA试验方法的相关问题及对策.ppt

ELISA试验方法的相关问题及质量控制 河北医科大学第二医院检验科 李永军 ELISA试验的方法学原理 一步法： Ab+Ag+Ab*→Ab—Ag—Ab* (a) Ab—Ag (b) Ag—Ab* (c) Ab*--Ag—Ab (d) 二步法 Ab—Ag+Ab*→Ab—Ag—Ab* Ab*+Ag→Ab*—Ag (洗涤) 固相导致抗原的变化 为了测定抗体的水平，需预先将抗原（包被）到极性和疏水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）微板上，利用直接物理吸附方法固相蛋白质抗原，可引起分子够象和抗原性发生改变 固相对抗体的影响 将抗体固相化时，直接吸附法固相抗体分子，除了呈团串状，不均匀分布，易解吸等外，还可发生构象改变，使抗体结合价减少甚至失活。 高剂量钩镰效应(HD-Hook Effects) 发生在固相法试验过程中的，可造成假低值甚至假阴性错误结果的特殊效应，称为HD-Hook效应。 边缘效应(Edge effects) 由于微量反应板周边孔与内部孔升降温速率的差别，造成周边孔与内部孔结果的差异，这就是边缘效应或位置效应 弥散效应(Diffusion limits) 在固相法中抗原抗体结合，底物与酶的接触，转换的信号产物向液体内弥散的过程中，液相与固相中的分子必须穿过液面的Nernst层，也就是液固屏障，使反应速率受到限制。 干扰物质 类风湿因子 补体 嗜异性抗体 血清粘度过大、血脂过高 胆红素、血红蛋白 抗凝剂（肝素、EDTA） 酶类 类风湿因子 类人血清中IgM、IgG型风湿因子可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接 结合，导致假阳性。 将热变性IgG（63℃，10分钟）加入到标本稀释液中。 用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中，使RF降解。 补体 在固相化和标记抗体的过程中，抗体FC段的补体C1q分子结合位点被暴露，使C1q可以将二者连接起来，造成假阳性。 用EDTA稀释标本。 用63℃，10分钟或56℃，30分钟加热使C1q灭活。 嗜异性抗体 人类血清中含有能与齿齿类动物（鼠）Ig结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，造成假阳性。 在标本稀释液中加入过量的动物Ig。 标本溶血 标本溶血可使红细胞破坏溶解释放出大量的具有过氧化物酶活性的血红蛋白，从而导致非特异性显色。 标本受细菌污染 菌体中含有内源性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本，在以辣根过氧化物酶为标记物的ELISA测定中，会导致非特异性显色。 标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会造成假阳性。 标本放置时间过长，有时抗原或抗体的免疫活性减弱，亦可出现假阴性。 5天内测定的血清标本可存放4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存。 标本凝集不全 在没有促凝剂和抗凝剂的情况下，正常血液采集后1/2—2小时开始凝固，18—24小时完全凝固。强行分离血清，血清中会有纤维蛋白原残留，形成假阳性。 充分凝固后分离血清；用带分离胶的采血管或采血管中加入抗凝剂。 添加物质的影响 抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂 （如NaN3)、分离胶等可干扰ELISA测定。 ELISA试验的有关问题 洗涤液 洗涤的目的：除去未结合的免疫反应物；终止抗原抗体的继续结合；除去血清中与反应无关的其它成份和游离的酶结合物；以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。 洗涤液的种类： 蒸馏水 吐温-蒸馏水 吐温-生理盐水 PBS-吐温-蒸馏水 Tris-吐温-蒸馏水 （PH均为7.2或7.4） Tween 20—月桂酸 （液体） Tween 40—棕榈酸 （液体） Tween 60—硬脂酸 （固体） Tween 80—油酸 （液体） 阈值(Cut off值，阴阳界值) 进行大量阴性标本OD值的检测，统计阴性标本的平均值和标准差。 以X+SD为界值，一个标本值小于此界值时，是阴性的可能性为68%。 以X+2SD为界值，一个标本值小于此界值时，是阴性的可能性为95%。 以X+3SD为界值，一个标本值小于此界值时，是阴性的可能性为99%。 为什么阴性标本会略显色而不是完全无色呢？ 由于目前分离、纯化、检测技术等方面的 限制，基因工程抗原和合成多肽都不可能达 到100%纯度，往往含有2-5%的杂蛋白。同时 ELISA反应板的非特异性吸附也不可避免。