乌司他丁对机械通气相关性肺损伤模型兔肺组织中TNF―α影响.doc

乌司他丁对机械通气相关性肺损伤模型兔肺组织中TNF―α影响 　　【摘要】 目的：建立机械通气相关性肺损伤模型兔肺组织，观察TNF-α在机械通气相关性肺损伤模型兔肺组织中TNF-α的变化规律，探讨乌司他丁对呼吸机所致肺损伤（ventilator-induced lung injury，VILI）的治疗机制是否与抑制TNF-α的活化有关。方法：采用大潮气量通气建立呼吸机相关肺损伤兔模型，模型成立后30、60、120、180、240 min，抽取动脉血作血气分析，采用ELISA法检测血清肺组织中TNF-α的含量，采用HE染色观察肺组织病理变化，运用Real-time PCR、Western Blot检测肺组织中TNF-αRNA、蛋白的表达。结果：家兔在大潮气量机械通气后，随着时间的增加血清中、肺组织中TNF-α表达显著增加，而采呼吸机相关性肺损伤模型兔在使用乌司他丁干预后，动脉血中的PaO2较前有所回升，血清与肺组织中TNF-αmRNA与蛋白的表达同大潮?饬孔橄啾扔忻飨灾?上升（P 　　1.2 实验仪器与试剂 DEVIBISS公司NEB-2000呼吸机；血气ABL800血气分析仪；PE生物9600DNA扩增仪；ABI7500型实时定量PCR仪；TNF-αELISA检测试剂盒（福州迈新生物技术公司）；RR036A反转录试剂盒、SYBR?Green I RR82LR（Takara） （大连宝生物工程公司）；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（建成生物研究所）；TNF-α抗体（美国abcam公司），β-actin抗体（美国CST公司），Western Breeze（美国invitrogen公司），PVDF膜（Amersham公司） 1.3 方法 1.3.1 干预前准备 耳缘静脉进针，戊巴比妥钠麻醉，行气管切开并插管，连接呼吸机。切开左侧皮肤分离颈总动脉进行动脉血采集。于右侧颈静脉置静脉套管针开放静脉通道，以每小时10 mL/kg持续输注葡萄糖生理盐水，补液并维持血压稳定。准备阶段的呼吸机通气方式：容量控制（CMV）：VT 8 mL/kg，FiO2∶40%，I∶E=1∶2，呼?饽┱?压（PEEP）3 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），维持呼吸频率30～40次/min、PaCO2 5.32 kPa左右 1.3.2 分组 稳定机械30 min后记录各项基础参数，并将此时时间点记录为0 h。将实验动物随机划分，每组8只，不同组予不同潮气量和通气时间：（1）常规潮气量组：继续初始通气条件VT 8 mL/kg通气。（2）大潮气量乌司他丁组：调节呼吸机至VT 40 mL/kg、呼吸频率8次/min。首次50 000 U/kg注射乌司他丁后，持续静脉输注5000 U/（kgh）。（3）大潮气量对照组：调节呼吸机至VT 40 mL/kg、呼吸频率8次/min。持续静脉输注地塞米松0.5 mg/（kgh） 1.3.3 检测指标 在分组操作完成后30、60、120、180、240 min，抽取动脉血行血气分析，抽取静脉血检测血清中TNF-α的含量。取血完处死后取肺组织，用于mRNA与蛋白的检测 1.3.3.1 血清肺组织中TNF-α含量的检测 静脉血离心取血清，肺组织液氮捣碎匀浆于组织稀释液中，试剂盒标准品分别加入96孔板上。并先后加入生物素、酶标底物，37 ℃温育60 min。加入终止液终止反应，显色15 min后，于酶标仪450 nm读取OD值 1.3.3.2 肺组织TNF-α蛋白的检测 提取肺组织的蛋白，测定蛋白浓度后，以30 μg/道上样，进行SDS-PGEE凝胶电泳， 然后采用半干转将胶上蛋白印至PVDF膜。室温封闭30 min。将1∶5000稀释的抗体封闭膜1 h，洗膜6次后将二抗室温封闭30 min，后再洗膜6次。将发光底物与膜在室温下孵育5 min，曝光、显影。应用Phoretix 1D生物电泳图象分析系统读每个条带的光密度值 1.3.3.3 肺组织TNF-αmRNA的检测 TNF-α引物：F 5CGCAAGAGTGTCTGGCGCAA 3’，R 5GGATGACGCG GAG ACGGA3’，产物长度145 bp。内参β-actin引物：F 5AGGCTGTCTTGTCCTGTA 3’，R 5ATGTCACGCCAGATTTCC 3’，产物长度176 bp。采用Trizol法提取肺组织RNA，抽提后的RNA加入溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，检验RNA是否降解，在确定无降解后测定RNA浓度，按试剂盒说明书步骤进行逆转录。逆转录后在ABI7500上扩增，得到扩增曲线与CT值。采用2-△△CT计算mRNA的表达量 1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示