大肠杆菌,敲除,方法.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（６）：６８７４ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 大肠杆菌基因组基因无痕敲除的优化方法 １ １ ２ １ １ 葛高顺 　张立超 　赵　昕 　胡学军 　李雅杰 （１大连大学医学院　大连　１１６６２２　２辽宁出入境检验检疫局　大连　１１６００１） 摘要　目的：优化大肠杆菌基因组基因无痕敲除的方法，提高无痕敲除的效率。方法：以无痕敲 除大肠杆菌ｎａｎＫＥＴＡ基因簇为模型，利用Ｒｅｄ同源重组系统和核酸内切酶ＩＳｃｅＩ的筛选作用，通 过两步连续同源重组无痕敲除大肠杆菌ＣＬＭ３７基因组中的ｎａｎＫＥＴＡ基因，优化无痕敲除时同源 ＤＮＡ长度与诱导用于筛选阳性克隆ＩＳｃｅＩ表达的诱导剂浓度。通过比较敲除ｎａｎＫＥＴＡ基因前后 菌株的生长曲线，研究大肠杆菌ＣＬＭ３７缺失ｎａｎＫＥＴＡ基因后的生长状态。结果：成功无痕敲除 大肠杆菌ＣＬＭ３７基因组中的ｎａｎＫＥＴＡ基因，并在无痕化处理时，通过延长与基因组同源ＤＮＡ的 长度，由通常使用的８０碱基对延长到６８４碱基对；并通过提高诱导筛选基因表达的四环素的浓 度，由５００ ｇ／ｍｌ提高到１０００ ｇ／ｍｌ后，使无痕敲除效率高达９０％以上。生长曲线研究表明，缺 μ μ 失ｎａｎＫＥＴＡ基因后的菌株生长状态与原菌株基本一致。结论：通过延长与基因组同源的双链核 苷酸的长度和诱导筛选基因表达的四环素的浓度可显著提高无痕敲除的效率。 关键词　大肠杆菌　基因组　无痕敲除　Ｒｅｄ同源重组系统　ＩＳｃｅＩ 中图分类号　Ｑ７８ ［４］ ［５］ 　　近几十年来，大肠杆菌是基因工程、代谢工程和合成 合法 ，两步Ｒｅｄ同源重组系统正负筛选法 ，Ｔｎ５靶 生物学等领域的重要工具菌株，是生产重组蛋白、氨基 ［６］ 向的Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ切除系统法 等。但目前的无痕敲除方 酸、有机酸、能源物质和一些重要化工产品的主力微生物 法普遍存在如操作步骤较复杂、周期较长、重组率较低 之一。为使大肠杆菌获得新的性状和生产能力，基因敲 等不足。最常用的方法是基于Ｒｅｄ同源重组系统和核 除及基因敲入是构建新型大肠杆菌的重要手段。 酸内切酶ＩＳｃｅＩ的切割筛选作用，其原理主要通过两步 　　目前，一种基于 噬菌体的Ｒｅｄ同源重组系统是 连续的同源重组实现无痕敲除，即先用带筛选标记的 λ 大肠杆菌等原核生物基因组修饰的主要方法，是遗传 抗性基因和核酸内切酶ＩＳｃｅＩ识别序列的片段敲除目 育种的有力手段［１］。传统的Ｒｅｄ同源重组方法主要是 的基因片段；再通过完全与目的基因上下游同源的片 先用两端带同源臂的抗生素基因片段或带有目的基因 段同源重组，依靠诱导核酸内切酶ＩＳｃｅＩ表达，切割筛 ［７］ 和抗生素基因片段替换特异的大肠杆菌基因组基因， 选去除未进行重组的菌株，达到无痕敲除目的 。但 再把抗生素基因片段通过重组酶（ｆｌｉｐｐａｓｅ，ＦＬＰ）同源重 在第二步同源重组时效率较低，即无痕化处理效率较 ［２］ 低，是该技术的主要瓶颈。 组去除 。但经过这种敲除后的基因组中还残留一个 ＦＲＴ序列的疤痕，残留的疤痕限制了再次利用该敲除 　　本研究以无痕敲除大肠杆菌 ＣＬＭ３７基因组