土槿皮乙酸抗人宫颈癌Siha细胞及其机制探究.doc

土槿皮乙酸抗人宫颈癌Siha细胞及其机制探究 　　[摘要] 目的 探讨土槿皮乙酸（PAB）对人宫颈鳞癌Siha细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用及其相关机制。 方法 根据不同PAB浓度和作用时间，将Siha细胞分为对照组（0 μmol/L）及1、2、4、8、16 μmol/L PAB组和24、48、72 h组。采用CCK-8试剂盒检测不同浓度（0、1、2、4、8、16 μmol/L）PAB作用不同时间（24、48、72 h）后对Siha细胞的增殖抑制率。采用免疫印迹法检测不同浓度PAB（0、2、4、8 μmol/L）作用48 h后Siha细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达变化。 结果 1、2、4、8、16 μmol/L PAB对Siha细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量-时间依赖效应关系。与0 μmol/L PAB对照组比较，2、4、8 μmol/L PAB组Siha细胞PI3K、p-Akt、p-GSK-3β和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达明显下调，促凋亡蛋白Bax表达明显增加（P 　　1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养 人宫颈鳞癌Siha细胞购于中国典型培养物保藏中心，培养于RPMI1640培养基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL），于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养 1.2.2 细胞增殖抑制率检测 Siha细胞以5×103/孔种于96孔板，24 h后更换含不同浓度PAB的培养基100 μL。药物浓度分别为0、1、2、4、8、16 μmol/L，每个浓度设6个副孔，分别于24、48、72 h更换CCK-8检测试剂100 μL（90 μL RMPI1640培养基+10 μL CCK-8液），于5%CO2、37℃恒温培养箱中孵育4 h，用酶标仪在450 nm波长检测各孔的吸光度值（A）。实验重复3次。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100% 1.2.3 免疫印迹实验 A2780细胞以2×105/孔种于6孔板，24 h后更换含不同浓度PAB的培养基1.5 mL，药物浓度分别为0（对照组）、2、4、8 μmol/L，48 h后吸出培养基，预冷PBS洗1遍，向每孔细胞中加入预冷的RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟）200 μL，冰上静置5 min后用细胞刮刮下细胞转入无菌EP管中，冰上裂解30 min。12 000g低温离心5 min，取上清，每个样本取20 μL上清用BCA法测定蛋白样品浓度，剩余蛋白上清加入上样缓冲液充分混匀后100℃水浴加热10 min。每孔20 μg蛋白体系，行10% SDS凝胶电泳，电转移至PVDF膜；3%脱脂奶粉封闭1 h，一抗（PI3K 1∶1000、Akt 1∶1000、p-Akt 1∶2000、GSK-3β 1∶1000、p-GSK-3β 1∶1000、Bax 1∶1000、Bcl-2 1∶1000、β-actin 1∶2000）4℃?u床孵育过夜；洗膜后加入荧光山羊抗兔二抗（1∶10 000）室温摇床孵育1 h，洗膜后于双色红外激光成像系统扫描收集荧光信号。以β-actin为内参照，采用QuantityOne-v4.6.2软件对Western条带进行定量分析，蛋白条带与内参的灰度比值为相对表达水平 1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各实验组与对照组间的两两比较采用Dunnett法，实验组之间的两两比较采用SNK法。以P 0.05）。此外，与2 μmol/L组比较，4 μmol/L组细胞PI3K和p-GSK3β蛋白表达降低（P 　　Bcl-2家族成员在肿瘤细胞凋亡中也发挥重要作用[20]。Bax活化后引起细胞色素C释放到胞浆中并与apaf-1结合激活Caspase-9，然后激活下游的Caspase-3等。在不同浓度PAB对诱导的Siha细胞凋亡中，本研究发现2、4、8 μmol/LPAB处理组Siha细胞促凋亡蛋白Bax表达明显增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下调，且呈现一定的剂量依赖性，表明PAB通过增加Bax/Bcl-2的比例，激活以线粒体为中心的信号转导途径而诱导细胞凋亡 综上所述，PAB为一种具有潜在抗人宫颈癌作用的中药活性成分，可通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路来抑制细胞的增殖，并通过促进促凋亡蛋白Bax的表达和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来促进宫颈癌细胞的凋亡，为临床应用PAB治疗宫颈癌提供了有力的实验证据和理论依据，为新药的研发开辟了新领域 [参考文献] [1] Li E，Clark AM，Hufford CD. A