基干寡核苷酸链汞离子荧光生物传感器.doc

基干寡核苷酸链汞离子荧光生物传感器 　　摘要基于G四链体结构和卟啉类化合物N甲基卟啉二丙酸IX（NMM）结合产生强烈的荧光，利用THgT错配对汞离子（Hg2+）的特异性识别，建立了一种简单、灵敏、高效的Hg2+检测新方法。在富含鸟嘌呤（G）寡核苷酸链中，引入了大量胸腺嘧啶（T）。在没有Hg2+存在时，可以自发形成G四链体结构，与NMM结合产生强烈的荧光； 在Hg2+存在时，可与另一条富含T序列的互补链通过THgT特异性结合， 形成双链DNA分子，从而导致G四链体结构不能产生。优化后最佳实验条件为：缓冲溶液的pH=6.7， 20 mmol/L KCl， 2.5 μmol/L NMM， 反应时间为2 h。在优化条件下，体系的荧光强度变化值与Hg2+浓度呈现良好的线性关系，线性范围为50～1000 nmol/L，检出限为22.8 nmol/L（3σ）。此生物荧光传感器对Hg2+具有良好的选择性。实际水样中Hg2+的加标回收率为106.1%～107.8%，可以满足实际水样品中Hg2+的检测要求 关键词G四链体； THgT错配； 汞离子； 荧光生物传感器 1引 言 汞是一种常见的重金属污染物，广泛存在于水、空气和土壤中[1]。可通过食物链在人体中富集，引起脑部、肾脏损伤和运动障碍等疾病，极大地威胁着人类健康[2，3]。因此，发展简单、灵敏、快速检测汞离子（Hg2+）浓度的方法具有重要意义。目前，常用的Hg2+检测方法有原子吸收光谱法（AAS）[4]、原子荧光光谱法（AFS）[5]和电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）[6]等，这些方法灵敏度和分辨率可以满足实际检测的需求，但是需要专业的操作人员和大型的仪器设备，不适合常规检测 G四链体结构是由富含鸟嘌呤的DNA中的4个鸟嘌呤通过氢键相互作用形成笼式结构[7～9]，可与卟啉类化合物N甲基卟啉二丙酸 IX（NMM）结合产生强烈的荧光[10]。与其它发光基团相比，G四链体/NMM复合物作为荧光报告基团，具有廉价、易于制备和储存等优点，已用于检测DNA[11，12]、RNA[13]、生物硫化物[14]和抗癌?物[15]等 Hg2+可以特异性地与胸腺嘧啶（T）结合，形成稳定的THgT配位化合物[16，17]。THgT的结合强度甚至超过了正常的TA配对的强度[18]。因此，THgT错配可以作为一种良好的Hg2+识别元件。基于Hg2+通过THgT错配可引起寡核苷酸链结构的变化、替换及重组的现象，研究者构建了许多Hg2+传感器[19]，包括基于荧光基团的荧光传感器[20，21]、基于石墨烯的电化学传感器[22]及基于金纳米粒子的比色传感器[23]，其中有些方法可以实现Hg2+的可视化检测[24]。然而，上述方法中，一般需要对相关材料进行化学修饰或者前处理，过程比较繁琐 本研究利用THgT特异性结合，基于G四联体/NMM复合物的独特荧光性质，建立了一种无需荧光标记、简单、实用的Hg2+检测方法 2实验部分 2.1仪器与试剂 3结果与讨论 3.1传感器工作原理及可行性分析 Hg2+传感器原理如图1所示。设计了两条寡核苷酸链P1和P2，P1为富G序列，可以自发形成G四链体结构。 同时，在P1的多聚鸟嘌呤序列中间引入了大量胸腺嘧啶。P2为富含胸腺嘧啶的P1不完全互补链，在Hg2+存在时，可以通过THgT错配，形成双链DNA分子。在无Hg2+存在时，P1自发形成G四链体结构，与反应体系中的NMM结合，产生强烈的荧光。当Hg2+存在时，P1和P2通过THgT特异性结合形成双链DNA分子，阻止G四链体产生，使得体系荧光信号下降，从而实现对Hg2+的检测 为了验证方法的可行性，测定了不同条件下的荧光光谱，结果如图2所示。当NMM单独存在时，背景信号比较微弱（图2a）。当仅加入P1和P2时，P1不能与P2互补配对形成双链DNA，P1自身形成G四链体结构，与NMM结合产生强烈荧光（图2d）。而当Hg2+存在时， P1和P2通过THgT错配形成稳定的DNA双链，导致P1的G四链体结构不能形成，从而造成荧光强度明显下降（图2c）。实验结果表明，基于上述原理可以实现对Hg2+的检测 0.2 mol/L Na2HPO4NaH2PO4缓冲液（pH = 6.1）中，加入不同浓度的KCl，室温反应0.5 h，测量荧光信号变化。如图3A所示，在0～10 mmol/L浓度范围内，随着KCl浓度增加，荧光信号大幅提高； 之后荧光强度增长缓慢，KCl浓度为20 mmol/L时，荧光信号达到最大值； 继续增加KCl浓度，荧光信号强度几乎不变。因此，后续实验采用20 mmol/L KCl 3.2.2NMM浓度的优化由反应原理可知，NMM浓度过低，不能完全结合形成的G四链体结构，造成