化验技术协会第7期培训资料2.docVIP

**************************************** 化验技术协会第七期培训资料 （药物分析工） **************************************** 高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。 1．对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。 (1)色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。 填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在l5nm(1nm＝l0)以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。 以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。 (2)检测器 最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器(DAD)，荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关，示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应，蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。 紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。 不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外—可见分光光度法项下对溶剂的要求，采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。 （3)波动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷健合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。 各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。 2．系统适用性试验 色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。 (1)色谱柱的理论板数（n） 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计，下同，但应取相同单位)和半高峰宽(Wh/2)，按n＝5.54(tR／Wh／2)2计算色谱柱的理论板数。 (2)分离度(R) 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为： 2（tR2-tR1） R=—————— W1+W2 式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；t