噬菌体随机肽库中文说明书phagedisplay.docVIP

目录 简介 ………………………………………………………………………………………………2 培养基和溶液 ……………………………………………………………………………………5 常规M13方法 …………………………………………………………………………………..6 淘选程序（固定靶分子）………………………………………………………………………..8 结合克隆的特征…………………………………………………………………………………..12 其他淘选方法（液相结合法）……………………………………………………………………..15 其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法）…………………………………………………..16 附录：优化肽结合相互作用……………………………………………………………………..19 文库的氨基酸分布………………………………………………………………………………..21 试剂盒组成： （如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）： ? 随机十二肽噬菌体展示文库 100 μl, 1.5×1013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度 ~2.7×109个转化子。 ? -28 gIII测序引物 5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/μl ? -96 gIII测序引物 5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/μl, 1 pmol/μl ? E.coli ER2738宿主菌 F’ lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk – m k– McrBC–)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70℃。 ? 链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉 1.5 mg ? 生物素，10 mM 100 μl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。 概述 噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因而是一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是野生型pIII蛋白。该文库含有~2.7×109个电转化序列，用10 μl本品提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产生~55个拷贝，对原始文库进行大量测序（见附录）表明该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。建议不要扩增原始文库来进行另外的淘选试验，因为一旦再扩增便会出现序列偏嗜现象。 NEB应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列（见图2）。大量实验证明，任何情况下该文库的复杂度都足以产生多个可编码相同肽基序的DNA序列。 图2用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。用抗?-内啡肽单克隆抗体对Ph.D.-12展示肽文库进行液相淘选，然后用ProteinA-琼脂糖（第1和第3轮淘选）或Protein G-琼脂糖(第2轮淘选)亲和捕