大鼠胰岛细胞原代培养.docVIP

大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,无菌取出胰腺,置于4Ｈａｎｋｓ液中,用眼科小剪刀将胰腺剪成1ｍｍ3大小的组织块,加入0.5ｇ·Ｌ-1胶原酶,37恒温水浴振荡消化15ｍｉｎ,将已消化至细颗粒状组织吸出,并用大量4Ｈａ ｎｋｓ液终止消化,余下未消化完全的组织加入少量37Ｈａｎｋｓ液,用粗口径吸管轻轻吹打,直至大部分组织被消化成细颗粒状,用大量4Ｈａｎｋｓ液终止消化。混合前后两部分的消化产物,用Ｈａｎｋｓ液低速离心洗涤3次后,将组织置于含100Ｕ·ｍｌ-1青霉素,100ｍｇ·Ｌ-1链霉素,11.1ｍｍｏｌ·Ｌ-1葡萄糖,10ｍｍｏｌ·Ｌ-1Ｈｅｐｅｓ和7%的胎牛血清的完全ＲＰＭＩ 1640培养液中,用150目(108μｍ)尼龙筛网过滤,以除去未被消化的组织和结缔组织。将已分离好的胰岛细胞和细胞团,置于含上述培养液内的培养瓶内培养。24ｈ后,吸出未贴壁的细胞悬液,低速离心以收集细胞,显微镜下计数后,以每孔一定数量胰岛细胞团接种于24孔细胞培养板内,继续培养48ｈ后用于实验。我分离胰岛细胞后,用DTZ染色,发现溶液中含有许多小颗粒,放入温箱中也未发生变化,镜下观察没有看到文献中所说的红染细胞。我是将100mg双硫腙粉末溶于10mlDMSO中，用滤纸过滤，用时用KRBB缓冲液稀释100倍。胰岛细胞分离是将成年大鼠胰腺用胶原酶消化后，过150目网取滤过液，再过400目网取网上细胞，加入L-DMEM培养。方法是我根据文献稍作改动后实施的。胰岛细胞分离和染色对于我都是第一次做，请高手指点一下。溶液中如果有紫黑色小颗粒，那就是DTZ，过滤除的不净。没有红染的细胞就是没有胰岛啊。还有，我总觉得150目太密了，很多胰岛都滤不过去吧大鼠胰岛细胞原代培养一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g 型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞，胰岛细胞移植的研究进展人类至今已有100多年用移植方法治疗糖尿病的历史，胰岛细胞移植治疗糖尿病存在两个障碍：组织来源不足和免疫排斥反应。一．胰岛细胞的来源1．同种的成人及胎儿胰岛 成人胰岛一般取自新死亡的健康尸体，抗缺氧的能力较弱，且慢存在外分泌活性组织，死亡之后即迅速自溶，故应用较为困难。而胎儿胰岛对低温缺氧的耐受能力较强、免疫原性弱、胰岛组织丰富、含有干细胞、移植后可保持正常的生长增殖能力，因此成为较为理想的供体组织。2．异种胰岛 猪的组织来源广泛，血糖调定点与人相似，猪胰岛素与人胰岛素排列极为接近，且能在新鲜的人血清组织中存活增生，猪胰岛成为最有可能的异种供体。3．胰腺导管细胞 胰腺导管细胞具有极强的扩增和分化能力，可在适宜的外部刺激下通过快速增殖丧失其导管细胞表现型，从而还原成多潜能细胞并进一步分化成为胰岛细胞。4．干细胞 根据来源分为胚胎干细胞和成体干细胞。5．基因技术产生的具有胰岛素代谢特征的新型细胞 运用基因从组技术和转基因技术，将胰岛素基因直接或间接转入