实验5有关物质的色谱检查 〔2〕2016.docVIP

实验课顺序：5 实验名称 实验五 有关物质的色谱检查 实验班级 07级药学本科 实验课时间 4.30 课时数 4 分组 10组 实验目的： 1、掌握HPLC法测定原料药中有关物质的原理与限量计算方法。 2、掌握TLC法测定原料药中有关物质的原理与测定方法。 3、熟悉高效液相色谱仪的工作原理和操作方法。 4、熟悉粘合薄层板的制备与活化。 5、了解高效液相色谱仪的主要部件和日常维护 实验原理： 实验器材： 试药：硅胶H，硅胶GF254，对二甲氨基苯甲醛，盐酸普鲁卡因注射液，马来酸氯苯那敏及氧氟沙星原料药。 仪器：高效液色谱仪，二极管阵列检测器，ODS 柱，层析缸，玻板，喷雾器，点样用微量注射器或微量吸管。 实验内容与方法： （一）盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸检查 本品为盐酸普鲁卡因加氯化钠适量使成等渗的灭菌水溶液。为无色的澄明液体。 [检查] 对氨基苯甲酸 精密量取本品，加乙醇制成每1mL中含盐酸普鲁卡因2.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取对氨基苯甲酸对照品，加乙醇制成每1mL中含30μg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录A）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于含有羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，用苯-冰醋酸-丙酮-甲醇（14：1：1：4）为展开剂，展开后，取出晾干，用对二甲氨基苯甲醛溶液（2%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液100mL，加冰醋酸5mL制成）喷雾显色。供试品溶液如显与对照品溶液相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液的主斑点比较，不得更深。 （二）马来酸氯苯那敏有关物质检查 本品为N，N-二甲基-g（4-氯苯基）-2-吡啶丙胺顺丁烯二酸盐。 [检查] 有关物质 取本品，加氯仿制成每1mL中含50mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加氯仿稀释成每1mL中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录A）试验，吸取上述两种溶液各10mL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以醋酸乙酯-甲醇-稀醋酸（5：3：2）为展开剂，展开后，晾干，在紫外光灯（254nm）下检视。供试品溶液除显氯苯那敏与马来酸两个斑点外，如显其他杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。 （三）氧氟沙星有关物质的检查 本品为（±）-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪基）-7-氧代-7H-吡啶并[1，2，3-de]-[1，4]苯并恶嗪-6-羧酸。为白色或微黄色结晶性粉末。 [检查] 有关物质 照高效液相色谱法测定（附录B）。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L枸橼酸溶液-乙腈（79：21）用三乙胺调节pH值至4.0为流动相；流速约为每分钟1.2mL；检测波长为293nm。理论板数按氧氟沙星峰计算应不低于2500。 测定法 取本品，加流动相制成每1mL中含1mg的溶液，作为供试品溶液；量取适量，加流动相稀释成每1mL中含0.05mg的溶液，作为对照溶液。取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%；再取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液色谱图上各杂质峰面积的和不得大于对照溶液色谱图主峰面积的1/5。并用二极管阵列检测器检测样品峰的纯度。 实验注意事项： 1.薄层色谱分析中为使斑点集中，点样应分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干。 ?? 2.薄层板放入层析缸时，薄板底边应水平浸入展开剂中，待展开至溶剂前沿距玻板顶端2～3cm时，取出薄层板。 ?? 3.展开缸必须密封，为使缸内展开剂饱和，薄层板放入前可在层析缸内壁贴滤纸条，让滤纸条一端浸入展开剂中，密封层析缸，待系统平衡后再将薄层板放入，展开。 ?? 4.HPLC测定中流动相使用前必须经过滤膜过滤和超声脱气。 ?? 5.HPLC测定完毕后，必须用水冲洗系统30分钟以上，然后再用甲醇冲洗。更换流动相时必须先停泵，待压力降至零时，将滤头提出液面，置另一流动相溶液中。 实验报告： 实验结束后，书写实验报告。 实验指导要点: ??1. 粘合薄层板的制备，根据玻板的大小，取一定量固定相，按比例加适量粘合剂（或水）研磨均匀，去除气泡，倒在玻板上，充分震荡，使成一均匀薄层。置水平位置晾干，110℃干燥30分钟，置干燥器内备用，注意保存时勿使薄层表面损伤。使用前检查表面光洁、均匀程度。 ??2. 点样斑点要集中，应分次点样，待前一滴干后再点第二滴，对照与样品应点在同一水平位置上，距底边2.0 cm，距薄层边约1.5cm。两斑点间距约1.5cm。 ??3. 展开剂量不宜太多，以不浸没样点为宜。展开距离为10～15 cm，使溶剂前沿距薄层顶边约2 cm。 ??4. TLC中杂质限量