小麦叶片生理指标测定.docVIP

小麦叶片生理指标测定 种子处理： 1、0.1%氯化汞浸泡小麦种子30分钟，进行消毒，小麦种子放在较大的培养皿中 将氯化汞倒入废液瓶，注意必须戴两层手套，因为氯化汞剧毒，且用完的手套不能碰实验室里其它的任何东西，以防污染，最好把用完的手套放到DNA显色室中的废手套收集桶里； 然后用无菌蒸馏水冲洗3遍以上 最后用倒入适量无菌水（稍微让水浸没种子表面）进行种子萌发，每天换次新水。 小麦培养 在种子发芽以后，在芽长1cm左右的时候，将种子放入用网缝好的塑料泡沫上，然后放入装有自来水的培养盒中 大概三天左右的时间，将水倒掉，换上1/2 hoagland 营养液（配方见下面的附件），每三天换一次营养液。 小麦处理及指标测定 小麦培养两周后，在两叶一心期，用适当PEG6000浓度的1/2hoagland营养液换掉原营养液，各设一个对照（即没加PEG6000的1/2hoagland营养液） 每隔24h取一次样，在72h后复水（即将PEG6000溶液倒掉，换成新配的1/2hoagland 营养液） 生理指标测定 相对含水量测定 ⒈ 鲜重测定 迅速剪取植物材料，装入已知重量的容器（或塑料袋）中，带入室内，用分析天平称取鲜重（FW）。 ⒉ 饱和鲜重测定 将称过鲜重的植物材料浸入水中，数小时后取出，用吸水纸吸干表面水分，立即称重；再次将材料放入水中浸泡一段时间后，再次取出，吸干表面水分，称鲜重，直到两次称重的结果基本相等，最后的结果即为饱和鲜重（SFW）。若事先已知达到水分饱和所用的时间，则可一次取得饱和鲜重的测量定值。 ⒊ 干重测定 提前把烘箱打开，温度升至℃。把称过鲜重的植物材料装入纸袋中，放入烘箱内，℃杀青10min，然后把烘箱的温度降到70℃左右，烘至恒重。取出纸袋和材料，放入干燥器中冷却至室温，称干重（DW）。 ⒋ 取得以上数据后，按公式相对含水量。 通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。 二、原理 丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol· L－1。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片。 2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。 3. 试剂：10％三氯乙酸；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。 四、实验步骤 1. 丙二醛的提取 称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。 2. 显色反应及测定 取4支干净试管，编号，3支为样品管（三个重复），各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。 五、丙二醛含量计算： 由于蔗糖－TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10－3，MDA－TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4×10－3和155×10－3。532nm非特异性吸光值可以600nm波长处的吸光值代表。 按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。 方程组： A450=（85.4×10－3）·C糖 （A532－A600）=（155×10－3）·CMDA+（7.4×10－3）·C糖 解得： A450 C糖= —————— =