二质粒DNA的微量提取(SDS法).ppt

实验二 质粒DNA的微量提取 碱裂解法（SDS法） 一.目的与要求 通过质粒的一些基本特性、质粒DNA的提取技术，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法。 二.相关知识 质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。绝大多数是一种环状的双链DNA分子。 广泛存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。 质粒DNA的存在区域和结构特征 电镜中质粒DNA的形态 严谨型：质粒的复制受到寄主细胞严格控制，与寄主细胞的复制偶联同步。因此，在一个细胞中只有1个或几个拷贝； 松驰型：质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200个拷贝。 用一定的药物处理，抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。 质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。 质粒类型： 载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制或表达的质粒(运载工具)。具备的条件: 1.具备条件 （1）易于鉴定； （2）在受体细胞中 可以独立复制； （3）易于筛选； （4）易于导入受体细胞。 2.结构特征 (1)抗性基因（Ampicillin gene, Kanamycine gene) (2)启始复制子（ori)； (3)多克隆位点(MSC)； (4)标记基因(LacZ gene)。 Insert EcoRI XhoI 1.9kb DNA 是具有一定结构的物质，特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。 三.原理： SDS是一种阴离子表面活性剂，既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。 四.细菌裂解的方法： (1)碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS;(2)煮沸裂解法:沸水煮沸40s;(3)SDS裂解法：10%SDS, 用于质粒大量提取。 五.DNA浓度的测定： (1)分光光度计法:碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常测定比较纯的样品。 (2)荧光的强度法： (3)凝胶电泳比对法，与标准分子量相比较。 六. 材料和仪器 1.材料: 含有质粒P3.5K-EGFP的大肠杆菌DH5α。P3.5K-EGFP是一种酵母荧光表达载体，常用于检测酵母中外源基因表达强度和亚细胞定位。 2.试剂： 裂解液一，裂解液二，裂解液三，酚氯仿，异丙醇，70%乙醇，TE等。 3.仪器设备： 高速离心机，移液器，摇床等 4.加入400?l新配制的裂解液二，加盖颠倒6-7次使之混匀，放置3-5min（不得超过5min）; 七.质粒微量提取的方法 培养细菌 收集菌体 悬浮菌体 裂解菌体 1.将带有质粒的DH5a接种到3-5ml含有amp抗生素的液体培养基，37℃培养12-16h; 2.取液体培养液1.4ml于Ep管中，10000rpm离心1min，去掉上清液，重复步骤2；最后瞬时离心后，用移液器去除上清。（所有去除残液均用此法） 3.加入200?l裂解液一，涡旋混匀放置5min; 5.加入300 ? L裂解液三 (乙酸钾溶液)，加盖后颠倒6-7次混匀，放置3-5min; 中和复性 6.用台式高速离心机，12000rpm离心10min。 离心除杂 12.将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。 9.沉淀用0.5mL70％乙醇清洗一次，12000rpm离心5min，弃上清，重复9； 11.加入20-30?l含有20?g/ml RNase的ddH2O或TE 溶解，室温放置15-30min，使DNA充分溶解. 去蛋白 沉淀洗涤 7.将700 ?L上清移入另一干净离心管，加入等体积的酚、氯仿（700ul），12000rpm离心10min。 10.瞬时离心，用移液器将管底残余液体移除，小管倒置于吸水纸上，室温自然干燥至透明; 样品干燥 样品溶解 样品保存 8.取600 ?L上清到另一离心管中，加入等体积冰冻异丙醇，混匀，12000r/min离心5min，弃上清; 离心收集 (1)取2?l提取的质粒DN