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第八章 电泳 一、 学习目的与要求 　　掌握电泳概念，电泳速度及凝胶电泳，了解其他几种常见电泳原理及特点，操作及应用。 二、 学习指南 　　 （一） 电泳速度（重点） 　　识记：电泳、迁移率概念 　　理解：了解自由溶液中的电泳速度和凝胶中的电泳速度 　　（二） 凝胶电泳（重点） 　　理解：凝胶电泳原理 　　应用：了解凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度的应用范围 　　（三） 不连续凝胶电泳（重点） 　　理解：等速电泳的原理特点，以及分离操作和分离特性 第一节 电泳的理论基础 1.1 电泳 定义：电泳是荷电溶质在电场作用下发生定向泳动的现象。 由于各种物质所带电荷的数量不同，因而，在电场中运动的速度也不一样。电泳法就是利用这种运动速度的差异来进行分离、纯化各种物质的方法。 电泳分离主要有区带电泳、等电点电泳、等速电泳等。这些电泳法又根据是否使用凝胶载体分为凝胶电泳和自由流电泳。 1.2 电泳速度 a)自由溶液中的电泳速度 静电引力: f=EZ 阻力: f=6πrην 当f＝f时，泳动速度为 由上式可知，相同带电颗粒在不同强度的电场里泳动速度是不同的。为了便于比较，常用迁移率代替泳动速度表示粒子的泳动情况。迁移率为带电粒子在单位电场强度下的泳动速度。若以表示迁移率：上式两边同时除以电场强度E，则得： b)凝胶中的电泳速度 凝胶具有分子筛的作用，可提高电泳分离度。常用的凝胶载体主要是聚丙烯酰胺凝胶，另外还有琼脂糖和淀粉等。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂聚合而成，凝胶的浓度 聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率的对数与之间呈线性关系，lgu=lgu0-KrTg,可预测根据蛋白质的荷电性质以及分子大小和形状等产生的凝胶分子筛效应进行电泳分离的特性。 第二节 电泳的类型及其原理 2.1 凝胶电泳 凝胶电泳利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离：相对分子质量大的溶质受到凝胶阻滞作用大，泳动速度较慢，而小分子溶质泳动速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含有不同溶质的区带，实现溶质之间的相互分离。 2.2 不连续凝胶电泳 最基本的凝胶电泳的凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一，为了提高凝胶电泳的分离性能，人们开发了不连续凝胶电泳法。 不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成。上层凝胶浓度较低，孔径较大，对溶质的泳动无阻滞作用，溶质在此层得到浓缩； 下层凝胶浓度较高，各组分根据荷电量和迁移率的差别得到分离。因此，上层凝胶称为浓缩层，下层凝胶称为分离层，在上层凝胶中溶质以等速电泳的形式泳动，得到浓缩。 等速电泳原理 定义：等速电泳是根据分子电荷的差别而不是分子大小差别来进行物质分离的。仅适用于同种电荷的分离。 原理:在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子为前导离子（Cl-)，迁移率最小的阴离子为末尾离子（甘氨酸离子），以阳离子为反离子，电泳开始时，将含有目标蛋白质的料液加入到前导离子和末尾离子之间。 等速电泳特点 1)等速电泳中扩散的影响很小，可以忽略不计。 2)提高前导离子的浓度，可使溶质得到浓缩。 3)采用适当的低分子两性电解质，在目标蛋白质前后作用间隔物,可使目标蛋白与其他蛋白质完全分离，得到高度纯化。 分离特性 利用不连续电泳分离蛋白质，可改变各种操作参数优化分离过程。例如，调节pH值可改变荷电量Z，调节凝胶浓度可改变迁移率，调节电压可改变电泳速度等。因此，选择适当的操作条件，可进行各种蛋白质的分离。 2.3 等电点聚焦 a)原理 一般的区带电泳利用溶质迁移率的差别进行分离，而等电点聚焦（IEF）利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH下呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离。在电泳设备中首先调配连续的pH梯度，然后使蛋白质在电场作用下泳动到等于各自等电点的pH区域，从而形成具有不同等电点的蛋白质区带。 b)装置 线圈型装置：将Ampholine装入长软管中，并将软管在水平方向上卷成线圈状，软管两端加电压，使溶质发生电泳。电泳结束后，剪断软管，回收分离软管中的组分。 柱式等电聚焦仪不使用密度梯度来稳定pH梯度，而是将待分离样品和两性电解质混合后，装入一长的塑料管中并在圆柱上绕上螺旋，然后进行电泳操作。 缺点： ①.载体两性电解质对产品产生污染； ②.pH梯度的稳定性不高； ③.操作过程中容易发生凝胶脱水起皱现象。