3蛋白组学-生物质谱2.ppt

碎片产生的模式 生物质谱仪可根据肽段的碎片离子之间的质量差进行氨基酸序列的推测。 生物质谱产生碎片离子的模式常采用CID、CAD、PSD等。 * 1、CID模式 离子经过电喷雾源在进入质量检测器前，施加一定的电压，使离子的运动速度大大提高，当离子与中性分子撞击时，发生如下反应： A++N→（A+）* → B++C++D+ A+：离子（母离子） N：中性分子如Ar、N2 （A+）*：激发态离子（含有过多能量的分子离子） B+、C+、D+：分子离子产生的碎片离子 缺点：碎片离子较复杂，图谱难以解析。 * 2、CAD模式 CAD与CID的原理一样，只是CAD采用串级质谱来实现分子离子产生的碎片离子的过程。 第一个四极杆质谱仪选择单一的母离子进入第二级质谱仪，第二级质谱仪内充有惰性气体，母离子飞入时与惰性气体分子发生碰撞产生碎片，碎片离子再经第三级质谱仪得以检验。 * 3、PSD模式 PSD是常用于反射飞行时间质谱的一种碎片产生模式。 由于在离子的产生过程中，分子离子获得足够的能量，在飞向反射场的过程中发生断裂，释放出多余的能量。 质量大的离子具有较高的动能，能进入反射场较深的位置；而质量小的离子由于动能较小，只能进入反射场较浅的位置。 * PSD测序 PSD mass spectrum of substance P in CHCA employing RE-TOF-MS. 15 kV accelerating potential, 50 laser pulses averaged for each reflector voltage segment. * 碎片谱图解析 由于蛋白质基本结构由肽键构成，肽键断裂的方式有ax、by、cz三种。 所产生的碎片离子分别为a、b、c、x、y、z六种类型。含有 N-terminal 碎片离子称为：a, b or c；含有C terminal的碎片离子称为： x, y or z. 根据键能的大小，主要以b、Y型离子为主。 * CID技术在肽测序方面的应用 含有 N terminal 碎片离子称为：a, b or c；含有C terminal的碎片离子称为： x, y or z. De novo 蛋白质测序 * * CID分类 低能（Low Energy） CID特点: 反应发生在四极杆分析器和离子阱分析器； 质谱图中出现 N terminal 碎片离子：a, b or c 和C terminal的碎片离子： x, y or z. 但主要是形成 a, b 和 y系列离子。 在碎裂过程中易丢失中性小分子NH3 和H2O， 分别形成 a*, b* 和 y* 和a0, b0 和y0。 高能（high Energy） CID特点: 反应发生在磁质谱分析器和飞行时间分析器； 质谱图中出现 N terminal 碎片离子：a, b or c 和C terminal的碎片离子： x, y or z. 但主要是形成 a, b 和 y系列离子。 * 串联质谱测定多肽序列原理 蛋白质由20种氨基酸组成，一段3个氨基酸的肽有203种可能排列方式，4个氨基酸的肽有204种可能排列方式，一个特定序列的4肽出现的概率为1／160000，所以五六个氨基酸残基的序列片段在一个蛋白质组中已具有很高的特异性，可以用来鉴定蛋白质。 y 、b系列相邻离子的质量差，即为氨基酸残基质量，根据完整或互补的y、b系列离子可推算出氨基酸的序列。 质谱方法不能分辨亮氨酸(L)与异亮氨酸(I)，二者为同分异构体，残基相对分子质量均为113.08406。谷氨酰胺(Q)与赖氨酸(K)的残基相对分子质量十分接近，分别为128.05858与128.09496，需要质谱仪的质量分辨率和准确度十分高才能正确分析。 * * 串联质谱测定多肽序列实例 核糖核酸酶B用糖苷内切酶除糖后，用Glu-C酶切，在酶切产物的肽指纹谱中，有一段m/z 4792.23的肽谱，其质量数与理论肽谱质量数不相符，后来经串联质谱分析，测得其部分序列为SAASSSNYCNQM，与理论序列比较后发现，此序列所在的酶切肽理论值与实测值相差203，恰好是一个N-乙酰氨基己糖的质量数，表明此肽上还连接有一个N-乙酰氨基己糖。 * * 肽谱理论序列： 阴影标记的部分为串联质谱解析出的序列，方框内序列为天冬酰胺序列子，N为糖基化位点。 肽理论质量[M+H]+ m/z：4589.10 肽实测质量[M+H]+ m/z：4792.23 实测值与理论值之差为 4792.23-4589.10=203.13（N-乙酰氨基己糖质量数） * 肽序列标签技术 串联质谱技术获取的肽序列谱图相对较复杂，需要计算软件帮助计算识别b、y等各系列离子，从谱图读出完整序列的解析较困难。 数据库检索鉴