分子发光.ppt

* 第四章 荧光分析法 一、分子荧光分析理论基础 （一）概述 处于分子基态单重态中的电子对（自旋方向相反）中一个电子被激发，跃迁至激发单重态轨道上，再从第一激发态最低振动能级返回基态的各振动能级时发射荧光。 单重态 三重态 S T 分子基态 激发态 + hυ (吸收辐射) - hυ 分子基态 荧光 第四章 荧光分析法 一、分子荧光分析理论基础 （一）概述 处于分子基态单重态中的电子对（自旋方向相反）中一个电子被激发，跃迁至激发单重态轨道上，再从第一激发态最低振动能级返回基态的各振动能级时发射荧光。 （二）激发光谱和荧光光谱 1．激发光谱：固定某一发射光波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱，得到荧光激发光谱。 2.荧光光谱：固定某一激发光波长，测定荧光发射强度随发射波长变化的光谱，得到荧光光谱。 荧光光谱的特点： 1、斯托克斯位移(stokes shift)：与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处。 2、荧光发射光谱与激发波长无关。 3．发光量子产率（φF）：定义为发光物质发射的光子数与吸收的激发光光子数之比。 φF=发射的光子数/吸收的光子数。 （三）影响物质发光的因素 1．分子结构与荧光 (1)共轭度大，发射波长红移，发光强度增加。 (2)刚性平面性结构分子荧光量子产率高。 联苯 芴 φF=0.2 φF=1.0 φF=0.11 φF=0.29 λem=278nm λem=321nm 2．取代基的影响 给电子基团(-OH、-NH2等)增加荧光强度。 吸电子基团(-COOH、-NO2等)降低荧光强度。 3．溶剂的影响 溶剂极性越大，增加荧光强度。 4．温度的影响 温度越高，降低荧光强度 （四）荧光定量关系式 稀溶液的荧光强度与浓度成正比： If =2.3 ? I0 ?lc 当入射光强度I0 和l 一定时， If = K c （K为常数） 荧光分析法的特点：灵敏度高，发光参数多，可进行动力学分析，分析线性范围比吸收光谱法宽，选择性比吸收光谱法好。但荧光寿命约为10-8秒。 二、荧光分析在医学中的应用 痕量分析： If =2.3 ? I0 ?lc= K c 使用激光光源，荧光定量分析的灵敏度甚至可达10-14 mol/l。使用激光光源的荧光分析法又称激光诱导荧光。 DNA荧光发光探针： 　　荧光探针在发光分析中应用广泛。 DNA （生命遗传的重要物质）分子的定量分析和特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。 但生物分子自身的荧光较弱，目前多采用荧光探针法检测。 荧光探针法较传统的同位素检测速度快，重复性好，用样量少，无辐射，在DNA 自动测序、抗体免疫分析、疾病诊断、抗癌药物分析等方面已得到广泛应用。 目前DNA 荧光探针的研究热点： （1）灵敏度（2）避免生物荧光背景的干扰 *