单克隆抗体的制备 .ppt

抗体制备 多克隆抗制备 单克隆抗制备 动物产生抗体的机理 抗原（非自己的物质）免疫动物 激活免疫B细胞 转化成浆细胞 分泌特异性的抗体 单克隆抗体制备原理 单克隆抗体杂交瘤技术基本流程 单克隆抗体的制备步骤 1.免疫原的制备 ： 完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质 半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 半抗原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体 2.免疫动物 选择体重18－20g BALB/C 雌性小鼠，用制备抗原免疫。50—100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。 一只兔子每次的免疫剂量：细胞抗原不低于1x107 ；可溶性抗原100ug－1mg；合成抗原为2mg（半抗原约为20－200ug），选用皮内、皮下、肌肉、静脉、或淋巴结内途径进行免疫，一般抗原免疫3－4次，合成抗原免疫6次以上，两次免疫间隔时间3周 3.细胞融合 取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50% PEG（Sigma）作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5%CO2的细胞培养器皿中培养。 4.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选 细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获50多个对上述抗原有反应的阳性孔。 5.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆 阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法，用包被液稀释成1－10ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60min;加入阳性孔培养上清100ul/孔，37℃ 1－2 小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1－2小时，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD492的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。获分别对上述抗原有特异性反应的阳性孔。筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获对上述抗原有特异性反应的杂交瘤细胞株。细胞株进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。 阳性孔的检测 杂交瘤细胞的冻存 杂交瘤细胞通常用含有8％--10%的二甲亚砜和20％小牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速升温，这样可以确保细胞有较高的存活率。 6.单克隆抗体腹水制备及纯化 取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。 7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定 将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试验。 ELISA方法 用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，腹水效价在10－5―10－7之间的可用于实际应用。 单克隆抗体和多克隆抗体的比较 免疫技术 原理：抗体与抗原表位的特异性结合反应，并利用酶与底物的显色反应、金颗粒、同位素、荧光素来间接显示 常见的几种免疫技术 酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assa