实时定量 PCR.ppt

Realtime PCR Detection System实时定量PCR技术及其应用 南 京 农 业 大 学 陈 溥 言 Realtime PCR detection system working procedure * * 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链 DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 PCR循环 = 双链DNA = 染料 = 荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB iCycler iQ Real-Time PCR Detection System 荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。 SYBR Green I Assays ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? SYBR Green I detection of genomic DNA. Amplification of the IL-1beta gene from human genomic DNA. A, 5-fold serial dilutions of human genomic DNA (50 ng to 16 pg) were amplified using gene-specific primers; B, standard curve of the serial dilution (r = 0.997, efficiency = 98.4%).  Molecular Beacons ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? Detection of p53 mutant and WT plasmid with the use of a molecular beacon probe. Wells C11 and C12, 104 copies of WT plasmid; wells D11 and D12, 104 copies of mutant plasmid; wells E11 and E12, 104 copies of both mutant and WT plasmid.  荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加， 直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便，无需跑胶 ? ? ? ? ? ? Gel bands ? ? ? MeltCurves ? ? Gel bands First Amplification cycle--Starting Quantities. Data dsDNA varies--different sizes. ? ? dsDNA 65-150 bp Amplicon ? 4.Cycle 20-30. ? 4.Cycle 40. ? 3.Extension 72oC 1-3 min. 3.Extension 72oC 1-3 min. or dont need. ? 2.Annealing 60oC 1 min. ? 2.Annealing 60oC 1 min. ? 1.Denature 95oC 1min. ? 1.Denature 95oC 1min. Protocol ? ? No dye SYBR Green or different kinds dye(FAM, TET..) Dye ? ? ? 50-20