细胞培养技术.ppt

（2） 细胞活力测定 A. MTT法 B. XTT法 C. CCK-8法 ? 三、培养细胞技术 5. 细胞增殖检测 （1）MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。  ?? 三、培养细胞技术 （2）XTT法 XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲瓒产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲瓒产物的吸光度与活细胞的数量成正比。 优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。 缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。  ?? 三、培养细胞技术 （3）CCK-8法或称WST-8法 CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。   ?? 三、培养细胞技术 （3）CCK-8法或称WST-8法 优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。 缺点：1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。  ?? 三、培养细胞技术 操作步骤： a. 96孔板细胞经过干预处理 b. MTT法：去掉培养液，加入80ul培养液+20ulMTT（0.5%） XTT法：直接加入XTT 50ul （0.1%XTT+1.5%硫酸甲醋吩嗦 PMS：1ml：30ul） CCK-8：直接加入CCK-8 10ul c. MTT法：培养4 h，加入DMSO 150ul溶解结晶，酶标仪检测。 XTT法：培养4 h，酶标仪检测。 CCK-8：培养1-4 h，酶标仪检测。   ?? 三、培养细胞技术  ?? 三、培养细胞技术 MTT法 XTT法 CCK-8法 甲瓒物水溶性 难溶性 水溶性 水溶性 检测波长 490 nm 450nm 450nm 性状 粉末 2瓶溶液 1瓶溶液 使用方法 配成溶液后使用 现配现用 毋需预制 使用有机溶剂 DMSO或其它溶剂 — — 方便性 + ++ +++ 检测速度 + ++ +++ 重复性 + ++ ++ 稳定性 ++ + ++ 工作量 --- -- - 对细胞毒性 --- -- - 对人体毒性 --- - - （4）BrdU法 （5）实时监测系统  ?? 三、培养细胞技术 6. 细胞周期分析  ?? 三、培养细胞技术 6. 细胞周期分析 细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。 G1期（first gap）　从有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点