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研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识 实验教学中心 侯孟君 基本概念 细胞培养技术 细胞系 细胞株 原代培养 传代 细胞系 培养物开始第一次传代培养后的细胞 有限细胞系（Finite Cell Line） 连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line） 肿瘤细胞系或株我国已建细胞系主要为这类细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞 具有不死性和异体接种致瘤性。 细胞株 用单细胞分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。 原代培养 直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。 优点： 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。 传代 将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养 原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。 传代注意事项 接种数量为5×104～8×105个/ml 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。 细胞培养的基本条件 无菌条件 细胞生长条件 细胞检测条件 细胞保存条件 实验室安全 细胞培养的无菌环境 无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 （使用前）紫外照射（1小时） 每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒 生物安全柜 使用前开启柜内紫外灯照射10－30分钟， 预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。 使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。 还要定期用福尔马林熏蒸。 常用培养器皿及清洗消毒 玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤 新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。  消毒前包装 常用的包装材料 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔 火焰消毒 在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 培养瓶 滴管、试管、吸管 细胞培养的实验用品 细胞培养瓶 25平方厘米，正方斜颈 25平方厘米，三角斜颈 75平方厘米，正方斜颈 75平方厘米，三角斜颈 150平方厘米，正方斜颈 细胞培养板 ?6孔， 12孔， 24孔， 48孔 96孔 细胞培养皿 ?35mm ?60mm? 100mm? 冻存管 1.2ml 2ml， 5ml 离心管 ?15ml ?50ml 细胞刮 滤 器 何处购买细胞 ATCC 细胞库(). 美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心(ATCC)是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的，非赢利性组织。 目前它可以提供以下物品 细胞系3000种 细菌和噬菌体 15000种 动植物病毒 2500种 原生动物 1200种以及重组物品 欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB)  国内细胞库 中国科学院细胞库 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心联系方法：地址：上海市岳阳路320号，200031电话：021Fax: 021联系人：陈松华，徐惠均e-mail: shchen@ /cctcc/fzlbc/pywml.htm 中国典型培养物保藏中心 也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物/生物材料／菌种保藏机构 订购程序 向中心订购培养物，可查阅CCTCC培养物目录，并向CCTCC提出订购培养物的名称、CCTCC保藏号等内容。 联系方式可通过电话、传真，信函，电子邮件等方式。 电话：027 传真：027 E-mail:cctcc@ 细胞系：300～500元/每株 菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。 细胞的营养 碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素 细胞培养液 水 平衡盐溶液 pH调节液 消化液 抗生素溶液 培养基 平衡盐溶液 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用 维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常