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倪培华-检验系-凝胶层析 层析技术介绍 一、层析技术的基本概念和特点 1、定义 层析(又名色谱)一种利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。 任何层析都有两相：固定相与流动相，两相互不相溶 固定相由层析介质组成，它可以是固体物质也可以是固定在固体物质上的液体物质。这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解与交换作用，对分离混合物起着关键作用。 流动相指在层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一定方向移动的液体或气体。柱层析中的流动相一般称为洗脱剂。它也是层析中的重要影响因素之一。 流动相在推动固定相中的混合物朝一个方向移动是，由于混合物中各组分的理化性质（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等）的差异，各组分受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用各不相同，在层析柱中移动速度也不同，从而使混合物中结构上只有微小差异的组分分离开来。 2、析法的特点 (1)分辨力高 (2)分析效率高 (3)灵敏度高 (4)应用广泛 局限性：在定量分析中需要纯制得标准物质；不能精确地解决物质的化学结构问题 2.按层析的原理可分为 吸附层析 分配层析 凝胶层析 亲和层析 离子交换层析 3.按操作形式不同 柱层析 平面层析:包括纸层析、薄层层析、薄膜层析等 三、常用的层析方法 1、凝胶层析 2、离子交换层析 3、亲和层析 4、吸附层析 5、分配层析 （一）凝胶层析 1、凝胶层析的原理 凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗粒，颗粒内部不是实心的，而是三维多孔网状结构。在洗脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因其直径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度。慢，比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因此得到分离。 固定相（凝胶） ——三维空间网状结构 2.凝胶层析的介质 凝胶是一种多孔网状结构物质。层析用的凝胶一般都呈球形，颗粒的大小通常以目数来表示。层析的分辨率和流速与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般常用的是100~200目。 目前常用的有交联葡聚糖凝胶，交联琼脂糖凝胶，丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶以及Superdex 交联葡聚糖凝胶：是最传统的凝胶介质，由葡聚糖于3-氯-1,2环氧丙烷相互交联而成。交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。 葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin合成 （商品名为Sephadex） 结构： 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂：3-氯代-1 ,2-环氧氯丙 烷使葡聚糖之间通过醚键交联 聚合而成的三维空间网状结构。 交联琼脂糖凝胶：商品名为SepharoseCL.琼脂糖为D-半乳糖和3,6（脱水）-L-半乳糖结合的链状多糖，经加热冷却后分子之间以氢键烦恼格式相互连接成线性的双链单环的琼脂糖凝胶。交联琼脂糖凝胶是由琼脂糖于1,3-二溴异丙醇交联而成的多孔网状结构。此类产品通常有Sepharose2B 、Sepharose4B、 Sepharose6B三种，分别代表含琼脂糖凝胶2%、4%、6%的凝胶。该凝胶具有良好的机械性能，分辨率高，分离范围广，广泛用于蛋白质的分离纯化和亲和层析的载体。 丙烯酰胺凝胶：商品名为Bio-gel.丙烯酰胺凝胶有 丙烯酰胺与交联剂甲叉丙烯酰胺聚合而成，化学性质稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影响，流速快，分辨率高。丙烯酰胺凝胶商品型号有Bio-gelP-2到Bio-gelP-300，其阿拉伯数字表示排阻极限。 Sephacryl凝胶：由丙烯酰基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺共聚生成的刚性凝胶，化学性质稳定，有良好的机械性能，可高温消毒，分辨率高，广泛用于蛋白质的分离与提纯。 Superdex:一种由Phamarica公司生产的新型凝胶过滤介质，有高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成，是目前分辨率和选择性最高的凝胶过滤介质。其物理化学性质稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影响，可高温消毒，流速快，分辨率高。现有Superdex30 Superdex75 Superdex200三种型号。 3、洗脱 凝胶层析所用的洗脱剂以能溶解被洗脱和不使其变性或失活为原则，除个