C3 核酸的光谱学和热力学特性.ppt

核酸的光谱学和热力学特性 要点 核酸的紫外光吸收 DNA的纯度 核酸定量 减色效应和增色效应 热变性及复性 * 嘌呤(purine) 腺嘌呤(adenine, A) 鸟嘌呤(guanine, G) * 嘧啶(pyrimidine) 胞嘧啶(cytosine, C) 尿嘧啶(uracil, U) 胸腺嘧啶(thymine, T) * 核酸的紫外吸收 嘌呤环和嘧啶环中含有共轭双键，因而都有吸收紫外光的性质，吸收高峰在波长260nm左右。 * * 减色效应 单一核苷酸RNA和ssDNAdsDNA,这种dsDNA相对于ssDNA吸收值减少的现象就成为减色效应。 dsDNA吸收值之所以最少，是由于碱基在疏水环境中的堆积所造成的。 * * 　　　在研究核酸、核苷酸、核苷及碱基时，可以此对核酸进行定性及定量分析。另外，紫外线照射可引起DNA突变，也是由于存在于DNA中的核苷酸吸收紫外光所造成的。 * OD260的应用:核酸定量 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50 ?g/ml双链DNA 40 ?g/ml单链DNA（或RNA） 20 ?g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 * 核酸定量 在研究核酸、核苷酸、核苷及碱基时，可以此对核酸进行定性及定量分析。 * DNA纯度 dsDNA的A260/A280=1.8 RNA的A260/A280=2.0 蛋白质的最大吸收峰为280nm 如果A260/A2801.8,说明有RNA污染。 如果A260/A2801.8，说明有蛋白质污染。 * * 溶解性： RNA和DNA是极性的化合物都微溶于水不溶于乙醇乙醚、氯仿等有机溶剂。 在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNA核蛋白(DNP)与RNA核蛋白(RNP)的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。 DNP溶于水和浓盐溶液，在1mol/L的NaCl溶液中溶解度比纯水高2倍，但在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解； RNP在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的NaCl溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。 * 核酸的热变性与复性 变性（denaturation） 核酸的变性是指核酸的互补配对碱基之间的氢键断裂，而构成磷酸-戊糖骨架的3,5-磷酸二酯键并未发生变化。 温度升高，溶液的盐浓度降低，或者溶液的酸碱度改变，都可以使核酸发生变性。实验室中最常用的使DNA分子变性的方法之一是加热。DNA分子的变性可以导致 A260增加。 * 变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 * RNA随温度升高碱基堆积会逐渐减少，光吸收值会逐渐地、不规则地增大。 dsDNA升温过程中，分子末端及内部富含A-T的区域的变性将会使其附近的螺旋变得不稳定，从而导致整个分子结构在一个确定的温度共同变性，这一温度取过渡期的中点值，称为解链温度（melting temperature），以Tm表示。 * * Tm值计算公式为： Tm＝69.3+41(G+C)% 少于20个碱基的寡核苷酸的 Tm＝4(G+C)+2(A+T)  * DNA的复性 DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 DNA复性时，其溶液OD260降低。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 * * 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。 核酸分子杂交(hybridization) * 与探针的杂交 * 讨论题 A同学做基因表达谱分析实验时从大豆的根中提取RNA样品， 她将纯化的RNA样品溶解在20?l的DEPC处理水中，然后取 2?l加480?l纯水使总体积达到500?l，再转移到比色杯中， 用紫外分光光度计测RNA样品的浓度并考察该样品的纯