细胞生物学3.细胞生物学研究方法.ppt

* * * * * 目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。 * 细胞工程的优势在于避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞，因而能够提高基因的转移效率。通俗地讲，细胞工程是在细胞水平上动手术，也称细胞操作技术。包括细胞融合技术、细胞器移植、染色体工程和组织培养技术。 * * 脾淋巴细胞不能长期生存，一般会在2周内自然死亡，SP2/0细胞不能在HAT培养液中繁殖，1周内也逐渐死亡，只有融合细胞在利用从脾细胞中得到的HGPRT酶获得了旁路DNA合成能力才能生存下去， * * * 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。 * 现在显微操作装置的设计愈来愈精密，不仅用于核移植，而且亦可对细胞核进行解剖和向核内注入基因。转基因动物制作中，常用向受精卵中注入目的基因，使基因整合到受精卵的基因组中，转入基因的受精卵经孕育发育成转基因动物。 在国际上，斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统（例如，神经系统、免疫系统、心血管系统、生殖系统等）的发育、功能和疾病（例如，神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等）的研究中，并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。我国开展斑马鱼相关的研究无论在规模还是在重视程度上都远远落后于国际形势发展的需要。 * * * * * 可以用于研究细胞内物质的吸收，运输以及化学物质的分布和定位等。 * * * * 普通荧光显微镜下，许多来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率降低，而共焦点激光扫描显微镜（Laser Confocal Microscopy） 则大大减少了这种焦平面以外的光，它在某一瞬间只用很小一部分光照明，这一束光通过检测器前的一个小孔或裂缝后成像，保证只有来自该焦平面的光成像，而来自焦平面以外的散射光则被小孔或裂缝挡住（图3-2）。这样所成的像异常清晰，共焦点激光扫描显微镜的分辨率可以比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4～1.7倍。所谓共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点。共焦点显微镜比普通显微镜有诸多好处。由于可自动改变观察的焦平面而且纵向分辨率（axial resolution）得到改善，所以可以通过“光学切片”观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构出样品的三维结构。共焦点显微镜在研究亚细胞结构与组分等方面的应用越来越广泛。 * DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 * 虽然光学显微镜技术仍然在细胞生物学研究中起着主要的作用，然而光镜的分辨率由于受照射光波长的限制只能达到一定限度，所以要研究细胞内部的精细结构，就必须借助于分辨率更高的电子显微镜（Electron microscopy）。 * * 电镜的分辨率与分辨本领并不等同， * 由于电子束的穿透能力有限，为获得较高分辨率，切片厚度一般仅为40～50nm，即一个直径为20um的细胞可切成几百片，故称超薄切片。这需要样品既要有一定刚性又要有一定韧性，而生物样品并不具备这些特性。为此，样品往往需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构，所以超薄切片样品制备的第一步就是样品的固定，以更好地保存细胞的精细结构。 * * * 又称冷冻蚀刻，冷冻复型（freeze-replica）、冷冻断裂（freeze-fracture）是一种由冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术。该技术是采用将标本置于干冰或液氮中冷冻的方法使样品迅速固定硬化，然后在真空中切断，升温使冰升华，暴露出断面结构，向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，形成复型膜，捞至钢网上在电镜下观察。 * 1982年，国际商业机器公司苏黎世实验室的葛·宾尼（Gerd Binnig）博士和海·罗雷尔(Heinrich Rohrer)博士及其同事们共同研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器——扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope,以下简称STM）。它的出现，使人类第一次能够实时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理、化学性质，在表面科学、材料科学、生命科学等领域的研究中有着重大的意义和广阔的应用前景，被