细胞计数法.docx

2016/4/27微生物學實驗八：微生物計數法原理與目的：測量懸浮液中微生物密度常用的方法有三：(1)直接計數法　在顯微鏡下算出固定體積培養液內的細胞數目，由於細菌細胞太小，容易與溶液中的灰塵混淆，此方法大多用於酵母菌、原生生物與單細胞藻類等較大型的真核微生物；(2)混濁度　利用分光光度計以波長590- 600 nm的可見光測量細菌培養液的混濁度，通常以OD600表示，其數值在0.9以下時與細菌細胞密度呈直線關係，讀取數值超過0.9時則先做10倍稀釋再測量混濁度，獲得的細菌密度乘以10即得到原本的密度；(3)平盤測定法將細菌培養液作連續10倍稀釋後取一定體積塗在平盤培養基上，培養後計算培養基上的菌落數目以推算出原本的細胞密度。本次實驗學習使用血球計數盤(hemocytometer)進行直接計數，使用可見光分光光度計測定混濁度，及了解標準平盤測定法的原理並學習其操作過程。材料：（每組）培養基：標準平盤計數培養基(standard plate count agar plate) × 5成分：0.5% tryptone, 0.25% yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agarYPD培養基× 5成分：1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1.5% agar菌種：細菌(Deinococcusradiodurans)培養液(in LB)5 ml酵母菌(Saccharomyces cerevisae)培養液(in YPD) 5 ml無菌白色旋蓋試管(長度10 cm內徑1 cm) × 25無菌5 ml移液管 × 5、移液管吸筒 × 1、P1000微量吸管 × 1、1000 ml微量吸管尖 × 1盒、P200微量吸管 × 1、P200 ml微量吸管尖 × 1盒、血球計數盤× 1、無菌水 80 ml 、96% 酒精 50 ml、酒精燈 × 1、250 ml燒杯 × 1、打火機 × 1、洗滌瓶× 1、廢液盤× 1、試管刷× 1、光學顯微鏡× 1、拭鏡紙× 3、接種環× 1共用器材：分光光度計× 1、歸零用試管(Blank) LB與YPD各 1、超音波洗滌器× 1、載玻片與蓋玻片各一盒、清潔劑步驟：步驟1-10進行酵母菌與細菌懸浮液的稀釋與細胞密度的直接計數將酵母菌培養液試管浸入超音波洗滌器中震盪30秒，以無菌操作利用接種環取出少量培養液，置於載玻片上，覆上蓋玻片後以顯微鏡檢查細胞是否完全分散，若仍呈團塊狀則再以超音波震盪30秒後檢查，反覆操作至細胞完全分散為止。取8支無菌試管，貼上標籤，註明B-10-1、B-10-2、B-10-3、B-10-4、B-10-5、B-10-6、B-10-7與B-10-8 (B代表細菌)。取8支無菌試管，貼上標籤，註明Y-10-1、Y-10-2、Y-10-3、Y-10-4、Y-10-5、Y-10-6、Y-10-7與Y-10-8 (Y代表酵母菌)。以5 ml移液管吸取4.5 ml無菌水至每一支試管中。以微量吸管取0.5 ml細菌培養液，加入B-10-1試管中。以移液管上下抽放數次使菌液與水充分混合。再以微量吸管由B-10-1試管抽取0.5 ml稀釋液，加入B-10-2試管中。以移液管上下抽放數次使菌液與水充分混合。依此類推直至完成連續十倍稀釋至B-10-8。依照步驟3-6的操作將酵母菌培養液作連續稀釋至10-8。由10-1稀釋液開始，以微量吸管吸取少許稀釋液在顯微鏡下觀察，選擇細胞密度適中(在顯微鏡下細胞不會互相重疊)的稀釋倍數，利用血球計數盤計算稀釋液中的細胞密度。血球計數盤的構造如右圖在 counting chamber的表面刻有細微的線條，以4×物鏡觀察時如下圖上圖中共有九個大格，四個角落的四個大格各有16個小格，每一個小格覆蓋的面積為1/16 mm2，位於中央的大格則劃分為25個小格，每一個小格所覆蓋的面積為1/25 mm2。每一大格覆蓋的面積則為1 mm2。將專用的長方形蓋玻片置於counting chamber的上方，並以微量吸管由sample introduction point注入稀釋液，依賴毛細作用使稀釋液滲入counting chamber中並覆蓋整個分格區域，此時chamber中稀釋液的厚度應為0.1 mm。計數酵母菌細胞時在10×物鏡下計數左上、左下、右上、右下四個大格中的細胞總數，再除以4求出一個大格內細胞的平均數目；計算細菌細胞時以40×物鏡計數中央大格中的左上、左下、右上、右下四個小格與中央一小格中的細胞總數，再乘以5算出一個大格內細胞的總數。由一大格所含的體積可計算出稀釋液中的細胞密度。壓線的細胞則以計算壓上方與右方格線的細胞，但不計算壓下方與左方格線的細胞為原則。將計算過程寫在實驗結果中。步驟10-16進行標準平