Chapter 7 表面活性剂在溶液表.ppt

Desalting proteins proteins salts 凝胶色谱填料 葡聚糖凝胶 Sephadex G-系列 聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列 琼脂糖凝胶 Sepharose系列 Superose系列 纸层析 是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析 介质：滤纸 操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹 展开剂的选择 展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂 常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2） 展开方式： 上行色谱，溶剂自下向上流动 下行色谱，溶剂自上向下流动，该法适合性质相近组分的分离 径向色谱 显迹：可采用化学试剂显色，如氨基酸层析体系中常用茚三酮试剂显色 薄层色谱法 将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法 常用的固定相有： 硅胶和氧化铝 优点： 设备简单、操作方便 快速 显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色 灵敏度高（较纸层析） 可以大量制备 HPLC,高效液相色谱 HPLC 分离原理 液固吸附色谱:按照极性大小顺序先后分离,非极性溶质先流出 液液分配色谱:类似于液-液萃取,同分配色谱 离子交换色谱:与离子交换中心的不同亲和力 空间排斥色谱:类似于分子筛效应,小分子易渗透保留在凝胶内. 30μm 15μm 5μm 反相液相色谱 液-液色谱有正相和反相之分。如果采用极性固定相和相对非极性流动相，就称为正相；如果采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液-液色谱系统一般可用于分离极性化合物。相反，反相液-液色谱系统一般可用于分离非极性或弱极性化合物。正相色谱的流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出；反相色谱的流出顺序正好相反。另外，其他有些色谱如柱色谱也有正反相之分。 反相液相色谱分离多肽和蛋白质是基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求。通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性 载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20 μm ） Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基 流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃 为什么反相色谱应用广泛? 它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。 适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。 保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。 所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。 选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。 蛋白质分离常用的色谱方法 免疫亲和层析 属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离 免疫亲和层析介质的获得： （1）获得抗体 （2）抗体连接到载体上 亲和色谱（Affinity chromatography） 载体活化、配基连接、吸附、洗脱 Competitive elution 疏水层析（HIC） 在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。 操作要点: 蛋白质的局部变性，盐浓度高疏水作用强，但高盐浓度下的选择性差 洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行，一般采用有机溶剂或非离子型的洗涤剂。 Mechanism of HIC 离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段 操作要点： 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定 pHpI, 蛋白质带正电荷, pHpI, 蛋白质带负电荷 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点） 缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在10~20m mol 层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整 洗脱方式：pH梯度 离子强度梯度 金属螯合层析 将螯合形成基团与琼脂糖等层析剂耦合，使层析剂能与过渡金属离子结合（如Cu2+,Zn2+,Fe3+）形成吸附中心，这些金属离子能与一些配基配位，可与氨基酸的咪唑基和