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HLA-B27检测操作流程 一、DNA的提取 1、取1ml RBC裂解液入血样管中混匀，裂解RBC; 2、离心4000rpm?2min; 3、重复步骤1-2两次，最后用棉签吸干管壁液体； 4、取50ulWBC裂解液入上述管中混匀； 5、将WBC管于60 ℃水浴消化20min； 6、取出WBC管再于100 ℃ ，3-5min，灭活蛋白酶K； 7、离心10000 rpm?2min。上清即为富含DNA的PCR模板。 * 二、PCR扩增 1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中； 2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min） × 12 × 23 94 oC 2min 94 oC 12sec 65 oC 1min 94 oC 12sec 61 oC 50sec 72 oC 30sec 37 oC 10sec HLA-B27扩增程序 * 三、电泳检测 吸PCR产物10ul加到2%琼脂糖凝胶孔内； 将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳160V?20min后取出，观察结果。 * 四、结果观察 0 * Specific bands can be seen with HLA-B27(+) samples * PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型技术 * PCR-SSP方法学评价 优点是简单易行。 缺点是不易自动化;不能检测新的等位基因,试剂盒需不断升级。 此方法适宜零散和纯度低样本,重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成像仪保留原始资料,增加实验成本。 * 以PCR扩增所要分析的基因片断,然后对DNA序列进行分析,可以直接得到基因型。分辨率高,可大规模进行,精确度高,能直接发现新的等位基因。但是由于杂合子的存在,无法分辨单元型。 PCR-SBT基因直接序列分析法PCR-DNA-Sequence-based Typing) * DNA水平HLA分型方法比较 SSOP法的优点是一次实验能够分析大量样本，在一张尼龙膜上可以探查96个或更多的样本 检测繁琐、费时 * SSP法能够非常快的提供定性结果 不足之处在于每个样本都需要大量PCR扩增，增加费用，且限制了能够一次检测的标本的数量 * 基于核酸序列识别的分型方法始终无法越过杂合子的难关。 * PCR-SSCP(PCR单链构象多态性分析,PCR-single strand conformational polymorphism) 基于序列分子构型的分型方法在理论上就避开了杂合子这个难题。 扩增的目标产物变形后形成单链,不同的序列,甚至仅有一个碱基的差异,就会形成不同的茎环结构,从而电泳速率不同。 * 但此方法仅限于分辨仅限于200-300bp; 且即使是同一单链DNA在相同情况下也会形成不同的构型,使得电泳条带很难分析; 也有可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小的情况,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。 * * 目前HLA-DNA分型技术各有优势，不能相互替代。 根据不同的用途选择适当的方法 * HLA分型方法的标准化 * * 新发展的RSCA(Reference Strand Mediated Conformation Analysis)技术根据HA的原理,设计了位点特异性荧光标记的参照DNA片段,与样本DNA分子的正反链形成异源二聚体.带有荧光标记的电泳条带易于分析,能够克服HA的不足。另外,提取基因组模板的技术也在不断发展。用于分型的DNA来源也已不局限于血液,口腔涂片、唾液中提取的DNA也有相似的效果(7.01＃261)。针对微量基因组模板的情况,现已开发出基于滚环复制的全基因组扩增技术,可以将1ng的模板扩大至100ng,足以应付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技术的要求。相信随着分子生物学技术的发展,未来HLA分型技术会向着更便捷,准确的方向前进。 * 7月4日 新开这本日记，也为了督促自己下个学期多下些苦功。先要读完手边的莎士比亚的《亨利八世》…… 7月14日 打牌。 7月15日 打牌。 7?月16日 打牌。 7?月17日 胡适之啊胡适之！你怎么能如此堕落！先前订下的学习计划你都忘了吗？ 子曰：“吾日三省吾身。”……不能再这样下去了！ ?7月18日 打