QPCR技术细节.ppt

* * * rRNA丰度高，占总RNA的80%，研究表达丰度较高的基因时比较适合；rRNA转录调节受其它因素影响，如28s和18s rRNA在有细分裂期间表达量明显减少或停止表达，所以在研究与细胞周期相关的基因时就不适合以此为内参；另外，由于表达量较高，在研究丰度相对较低的基因时，有时就不太适用，比如Multiplex。当然也有rRNA的忠实拥护者，有人认为表达量高才时定量准确的关键，总之各有说法，但选择看家基因最关键的地方还是看该基因在你所研究的体系下是否稳定表达，可通过选择两个看家基因在不同的处理间相互比较，看两者比值是否恒定，如果一致，那么他们都可用作这个实验的看家基因。 * * 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 相对定量分析——管家基因筛选 0 1 2 3 4 5 6 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 实验组 实验值 β-Actin GAPDH β-2-microglobulin HPRT P P P O * 双标准曲线法 2 -△△Ct法 相对定量分析——两种常用的分析方法 * 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 相对值= 校正值= 目的基因定量结果 管家基因定量结果 待测样品的校正值 对照样品的校正值 相对定量分析——双标准曲线法 公式： * 优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 相对定量分析——双标准曲线法 检测样品 管家基因H 目的基因X 定量结果 定量结果 校正值 相对量 对照样品 6391.5 343.4 0.0537 1.000 待测样品1 8589.7 17.3 0.0020 0.037 待测样品2 7432.9 1946.1 0.2618 4.874 实验数据 * 公式： F = 2 － 相对定量分析——2 -△△Ct法 优点：无需作标准曲线 缺点：假定扩增效率为 100 %； 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 待测组目的基因平均Ct值 待测组管家基因 平均Ct值 对照组目的基因 平均Ct值 对照组管家基因 平均Ct值 － － － * 实验数据： Sample 处理前 处理后 Jun(MeanCt) GAPDH(MeanCt) E 18 16 17 17.4 1.95 1.95 2 - △△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100% △Ct（处理前）＝18－17＝1 △Ct（处理后）＝16－17.4=－1.4 △△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－1.4－1＝－2.4 比率（处理后/处理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4） = 5.3 所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍 相对定量分析——2 -△△Ct法 * * * 发表文章 Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 in Macrophages Restrains TLR4-NF-κB Signaling and Protects against Endotoxin Shock. Immunity.(2014)(影响因子：20.72) HCV-Induced miR-21 Contributes to Evasion of Host Immune System by Targeting MyD88 and IRAK1. Plos Pathog. (2013)(影响因子：9.12) Inhibition of Lysyl Oxidase Ameliorates Inflammation and Experimental Pulmonary Fibrosis.J MOL CELL BIOL.(2014)(影响因子：7.31) Exogenous Melatonin Modulates Apoptosis in the Mouse Brain Induced by high-LET Carbon Ion Irradiation. Journal of Pineal Research.(2012)(影响因子