生物化学实验复习.docx

实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法【实验原理】纸层析法使用滤纸作为惰性支持物的分配层析法；层析溶剂由有机溶剂和水组成；物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离；在一定条件下某种物质的Rf值是常数，Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。【实验器材】层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、层析滤纸【实验试剂】（1）扩展剂：是四份水饱和的正丁醇和一份醋酸的混合物；（2）氨基酸溶液：0.5%赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液以及它们的混合物（各组分浓度均为0.5%）；（3）显色剂：0.1%茚三酮-正丁醇溶液。【操作方法】将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中；取层析滤纸一张，在纸的一段边缘2~3cm处用铅笔划线，每隔2cm做一个记号；用毛细管将各氨基酸样品分别点在这四个位置，干后再点一次；用别针缝成筒状，将盛有20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中并将滤纸直立于培养皿中，待溶剂上升15~20cm时取出滤纸，用铅笔描出溶液前沿界限，自然干燥或用吹风机热风吹干；用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮-正丁醇溶液，置于烘箱中烘烤5min（100℃）或用热吹风吹干；计算各种氨基酸的Rf值。【实验结果】Rf值（迁移距离）从大到小依次是亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、赖氨酸。【注意事项】在操作过程中，手不要摸滤纸；点样直径不超过3mm；点样的一段朝下，扩展剂的液面需低于点样线1cm；及时取出滤纸，以免出现氨基酸层析跑到滤纸外面而不能检测。实验二蛋白质的性质实验（一）——蛋白质及氨基酸的呈色反应【氨基酸颜色反应】【呈色反应】1、双缩脲反应：[原理]尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨；双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色复合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双锁脲相似，也能发生此反应，可用于蛋白质的定性和定量测定。[补充]双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH——NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团以及乙二酰二胺等物质也有此反应。NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可以生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）4 2+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定是蛋白质或多肽。【实验步骤】取少量尿素结晶，放在干燥管中，用微火加热使尿素溶化，熔化的尿素开始硬化，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲；冷后，加10%氢氧化钠溶液1mL（提供碱性环境），震荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再震荡，观察出现的粉红色（注意：要避免添加过量硫酸铜，否则生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色）；向另一支试管中加卵清蛋白溶液约1mL和10%氢氧化钠溶液约2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。2、茚三酮反应：[原理]除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生呈蓝紫色物质；β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应，尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应，因此，虽然蛋白质和氨基酸都有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质和氨基酸，在定性、定量测定中，要严防干扰物存在；该反应十分灵敏，1:1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法；茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原性茚三酮，第二步是所形成的还原性茚三酮和另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质；此反应的适宜PH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH下颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。[操作]取两支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1mL，再各加0.5mL0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2min，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝；在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，再微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。3、黄色反应：[原理]含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠；多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。坂口反应：[原理]精氨酸和许多胍代化合物与α-苯酚在碱性次溴酸钠溶液中发生反应，生成红色物质；精氨酸是唯一呈此正反应的氨基酸，反应极为灵敏，可用作定性鉴定含有精氨酸的蛋白质和定量测定精氨酸。[注意]本实验十分灵敏，α-苯酚过量，次溴酸钠、精氨酸、蛋白质均不可过量，过量的次硫酸钠可继续氧化