基于PB技术的Cre特异性表达小鼠品系的筛选研究详解.PDF

二、结题报告 基于PB 技术的Cre 特异性表达小鼠品系的筛选研究 王菲 复旦大学生命科学院 指导老师：吴晓晖 复旦大学发育生物研究所 摘要：哺乳动物基因功能的研究是当今生物学研究的焦点，条件性基因剔除技术是研究基因功能最常 用的方法之一。条件性基因剔除小鼠的研究离不开Cre 品系的培养和鉴定。由于传统技术的种种劣势， Cre 小鼠品系的培育已被公认为是大规模小鼠基因研究的一个瓶颈。piggyBac （PB ）转座子可以在哺 乳动物基因组中高效转座，我们使用PB 转座子介导的基因捕获系统大规模培育Cre 小鼠品系，使用 Luciferase 和LacZ 两种报告基因确定Cre 的表达谱。通过筛选，我们已经获得一个附睾特异性表达的 品系，并已经初步建立了一个可供大规模筛选的标准化流程。 Abstract: Conditional knockout (CKO) is one of the most common ways to gene function research which is more and more popular in biology science. Developing of different Cre lines is crucial to CKO mice and is widely considered to be the choke point to mouse gene research due to the disadvantages of traditional technology. Piggyback (PB) transposon can efficiently transpose in mammalian genome. We designed a PB-mediated gene trap to develop Cre lines in a large scale. Two reporter genes, Luciferase and LacZ, were used to trace the expression pattern of Cre. We obtained a PB trap line with epididymis-specific expression pattern of Cre and roughly established a standard protocol for a large scale screen. 关键词：Cre 品系，PB 转座子，基因捕获，附睾特异性表达 引言 小鼠是研究哺乳动物的基因功能的必备模型，最常用的小鼠基因功能研究方法之一是利 用基因剔除技术产生突变型，根据突变表性分析基因的功能。该方法因其巨大的理论和 应用价值获得了2007 年诺贝尔奖。由传统基因剔除发展而来的条件性基因剔除技术，是 在目的基因两侧引入了LoxP 序列，通过Cre 重组酶的表达诱导基因缺失。该方法可以使 用实现基因在不同发育时间和组织中的突变，可以用于研究致死基因在成年期的功能， 并可帮助我们了解特定基因在不同组织或器官中的作用，已被世界各国的研究人员广泛 使用。2007 年发起的国际小鼠基因剔除计划（IMKC ）也正在使用该方法在小鼠胚胎干 细胞（ES 细胞）中大规模诱变小鼠基因，为今后大规模培育条件基因突变小鼠做准备。 条件基因剔除小鼠的研究离不开 Cre 品系的培养和鉴定。传统方法的Cre 小鼠大多通过 转基因培育：首先克隆出组织特异性表达的启动子序列，将 Cre 编码序列置于其后，通 过线性片段随机插入的方法建立转基因 Cre 小鼠，从而使Cre 在人工克隆出的启动子的 作用下实现组织特异性的表达。这一方法受到许多限制。首先，已被鉴定和克隆的组织 特异性启动子数量不多；其次，转基因的位置效应会影响 Cre 的组织特异性表达，为克 服位置效应则往往需要筛选多个转基因品系，消耗大量的时间和费用。理论上也可以利 用基因打靶技术培育 Cre 小鼠，但这一策略同样受到对基因表达调控序列认识的限制， 并需要ES 细胞培养等昂贵步骤。由于这些原因，Cre 小鼠品系培育已被公认为是大规模 小鼠基因研究的一个瓶颈。 针对Cre/LoxP 重组系统存在的问题