外源性硫化氢对大鼠睾丸缺血再灌注损伤保护作用.doc

外源性硫化氢对大鼠睾丸缺血再灌注损伤保护作用 　　[摘要] 目的 探讨外源性硫化氢对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的保护作用。 方法 选取成年雄性Wistar大鼠30只随机分为3组，每组各10只：对照组（A组）、睾丸缺血再灌注损伤组（B组）、睾丸缺血再灌注损伤+硫化氢干预组（C组）。B组和C组大鼠建立睾丸扭转复位模型，C组在再灌注前腹腔注射外源性硫化氢（100 μmol/kg）。HE染色观察睾丸组织病理改变；测定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量；采用原位缺口末端标记检测细胞凋亡指数；免疫组化检测睾丸组织中的Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达情况。 结果 B组可见生精上皮排列紊乱，生精细胞广泛脱落。与A组比较，B组中MDA含量和生精细胞凋亡指数明显升高，SOD活性明显下降，差异有统计学意义（P 　　1 材料与方法 1.1 试剂及器材 NaHS（H2S外源性供体）（Sigma公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；原位细胞凋亡检测试剂盒（德国罗氏生物技术有限公司）；Caspase-3，Bax、Bcl-2抗体（加拿大圣克鲁斯公司）；免疫组化检测试剂盒（福建迈新公司） 1.2 实验动物和分组 30只成年雄性Wistar大鼠，年龄约10周，体重250～300 g，购于湖北省疾病预防与控制中心。随机分为3组，每组各10只。实验前，所有大鼠饲养在恒定温度的房间（22±2）℃，给予相同的食物和水。所有大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉。对照组（A组）：左侧睾丸行阴囊切口后缝合切口，不给予任何干预措施，8 h后麻醉取材；睾丸IRI组（B组）：左侧阴囊切口，720°顺时针扭转睾丸，5-0丝线固定于阴囊皮肤，扭转2 h后睾丸恢复自然位置，再灌注6 h后麻醉取材；睾丸IRI+H2S干预组（C组）：在B组基础上，再灌注前腹腔注射外源性H2S（100 μmol/kg ），再灌注6 h后麻醉取材 1.3 取材及?吮局票? 再灌注后6 h，快速脱颈椎法处死所有大鼠，快速采集左侧睾丸标本。仔细剪除附着的脂肪组织和筋膜，生理盐水冲洗后以滤纸拭干用于随后的实验 1.4 HE染色 在相对无菌的条件下，用生理盐水将睾丸组织冲洗干净后，置于4%的甲醛溶液中固定24 h，然后行石蜡包埋。5 μm厚切片，脱蜡，水化后并进行HE染色，光镜下观察睾丸组织的形态学改变 1.5 MDA和SOD测定 MDA和SOD是氧化应激的指标。冷冻的睾丸组织匀浆、离心（3000 r/min，10 min），然后收集上清液。MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定，SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法，操作按照说明书指示进行。于吸光度在532 nm处测定MDA水平，单位为 nmol/g蛋白。在吸光度550 nm处检测SOD活性，单位为U/mg蛋白 1.6 生精细胞凋亡检测 生精细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法，细胞核染成棕色者为TUNEL阳性细胞，光镜下（200×）每张切片选取10个视野，计数500个细胞。生精细胞的凋亡指数（AI）= 阳性细胞数/细胞总数×100% 1.7 免疫组化 Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达采用免疫组化染色分析，所有的步骤按说明书指示进行，显微镜下棕褐色为阳性染色。采用Image-Pro Plus 6.0进行免疫组化的图片分析，每张切片随机选定5个视野，设定基线标准染色强度的判定标准后，测定5个视野下的平均光密度值，其值越大，染色越深，反映细胞内蛋白表达量越高 1.8 统计学方法 采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P 　　氧化??激是ROS过量产生或细胞内抗氧化机制障碍导致的活性氧自由基大量积累的结果。过量的活性氧可以氧化细胞膜蛋白、脂质和DNA，导致一系列细胞功能障碍或死亡[12-13]。IRI过程中伴有氧自由基的产生，而后者促进了IRI的进一步发展。MDA是脂质过氧化分解产生最终产物，通常可作为氧化应激水平的标志物。SOD是细胞生长、分化过程中的重要组成部分[14]， 其抗氧化能力可改善睾丸IRI的损伤[15-16]。在本研究中，经H2S处理后，可明显减轻IRI睾丸组织的脂质氧化，同时可降低MDA含量，提高SOD水平。这表明外源性H2S对睾丸IRI引起的氧化应激产生了保护作用 细胞凋亡是一种正常的生理现象， 也是一种基于遗传学机制的细胞死亡模式，通过诱导一系列形态和生化的改变导致细胞死亡的过程，在维持精子发生的