实用HPLC方法建立.ppt

实用HPLC方法的建立 华东理工大学分析测试中心 施超欧 2003.03.30 目录 1 前言 2 HPLC方法建立的步骤 2.1 了解样品的有关情况 2.2 明确分析目的 2.3 样品的预处理与检测 2.4 HPLC分析模式的选择 2.5 色谱条件 2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理 2.7 定性和定量方法的建立及论证 3 色谱条件的选择 3.1 流动相的选择 3.2 检测器的选择 3.3 样品的溶解及预处理 3.4 样品的进样量 3.5色谱柱的选择及保护与再生 3.6 泵的选择 3.7 色谱工作站 4 分析方法建立的实例 4.1 等度分析 4.2 梯度方法的建立 4.3 色谱柱及pH的影响 5 色谱分析中各种图谱现象的判断 5.1 基线噪音的产生和处理 5.2 基线漂移(上漂和下漂) 5.3 倒峰的产生和消除 5.4 鬼峰的产生和消除 5.5 峰前移和退后的判断 5.6 前沿峰和拖尾峰的判断 5.7色谱双峰的判断 5.8 色谱峰变胖的判断和处理 1 前言 HPLC作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手段。 HPLC技术的发展和科技的进步，使得HPLC广泛应用到各个领域。 HPLC实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要。 HPLC技能是一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。 出的来，跑的快，分的开 2 HPLC方法建立的步骤 2.1 了解样品的有关情况 首先应对样品有足够的了解，并明确分析目的（同一样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致）。 样品的重要性质包括： 所含化合物的数目； 化学结构（官能团）； 分子量； pKa值； UV光谱图； 被测组分在样品中的浓度范围； 样品的溶解度、沸点及其稳定性； 可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。 1 分析大分子、小分子还是生物分子 一般常规的HPLC分析分子量2000以下，大分子一般采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱体系。 2 样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。 如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是系列反应的产物。 3 测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。 主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。 4 分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。 非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可采用反相体系。 弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加改性剂，调节合适的pH。 离子化合物可以采用反相，调节pH；或者添加离子对试剂；也可采用离子交换。 两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的则考虑离子交换；也可考虑衍生后测定。 对于极性的糖类物质，可用NH2柱，有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。 大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，多为聚合物柱子。 手性化合物，则要用手性流动性或者采用手性柱。 6 样品的稳定性 如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。 对光敏感物质，用棕色瓶，避光保存，不宜存放，随配随做。 易水解的物质、要选择合适的溶解溶剂。 有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用乙腈。 易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节pH，如PAP的测定。胺类化合物。 产品不稳定的化合物，分析越快越好。 7 化合物的化学结构（官能团） 常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有COOH、OH、NH2、SO3H、Cl（Br）、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-等。 亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。 从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。 8 化合物的pK 值 知道pK值，有助于方法的建立，尤其流动相pH的选择。 pK的差异是官能团造成的。 9 UV光谱图 知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有DAD则关系不大。多组分的样品，宜多选几个波长。 同一样品在不同的流动相及pH最大波长可能不一致。 有双键共轭的结构紫外吸收较大，单键的则在低紫外区有一定的吸收 10 样品的复杂层度 梯度方法分析 预处理,分成几个部分分析 痕量物质的富集 总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难度。 2.2 明确分析目的 1 定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱鉴定？ 2 是否将所有组分分开，定性？一种条件有困难？分组分析？ 3 定量分析的准确度和精密度？（主成分在1～2