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226 2015, Vol.36, No.20 食品科学 ※安全检测
基于内参的大肠埃希氏菌O157 H7实时荧光
∶
定量PCR快速检测方法的建立
王建昌,王金凤,段永生,李 静,陈志敏,陈瑞春*
(河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心,河北石家庄 050051 )
摘 要: rfbE Flic
针对大肠埃希氏菌O157 ∶H7 和 靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入
内参(internal amplification control ,IAC ),建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应(polymease
E. coli μL
chain reaction ,PCR )检测方法。结果表明,该方法对 O157 ∶H7基因组DNA 的最低检测限为1 pg/ ;对含有
3 μL 3
靶基因质粒的最低检测限为10 copies/ ;对细菌的最低检测限为5 ×10 CFM/mL ;Ct值与模板拷贝数均呈良好的
线性关系(R2=0.999 )。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g 时,采用水洗加试剂盒法提取DNA ,
E. coli O157 ∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E. coli O157 ∶H7实
时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157 ∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止“假阴性”的发生。
rfbE Flic
关键词:大肠埃希氏菌O157 ∶H7 ; ; ;实时荧光定量PCR ;内参
Development of Real-Time Quantitative PCR Assay for the Detection of E. coli O157:H7 Based on
Internal Amplification Reference
WANG Jianchang, WANG Jinfeng, DUAN Yongsheng, LI Jing, CHEN Zhimin, CHEN Ruichun*
(Technology Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang 050051, China)
Abstract: Based on the rfbE and Flic genes of Escherichia coli O157:H7, the specific primers and probes were designed,
and a real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was developed. An internal amplification control (IAC) was
added to the reaction system to monitor the performance of reaction system. The assay could be used reliably to
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