核酸分子原位杂交.pdf

第四章 核酸分子原位杂交 核酸分子原位杂交技术的建立和发展 原位杂交的实验程序 核酸分子原位杂交技术的建立和发展 原位杂交的实验程序 核核酸酸分分子子原原位位杂杂交交技技术术的的建建立立和和发发展展 原原位位杂杂交交的的实实验验程程序序 探针的类型、标记和鉴定 对照实验 探针的类型、标记和鉴定 对照实验 探探针针的的类类型型、、标标记记和和鉴鉴定定 对对照照实实验验 探针的类型和标记方法 荧光原位杂交 探针的类型和标记方法 荧光原位杂交 探探针针的的类类型型和和标标记记方方法法 荧荧光光原原位位杂杂交交 探针的标记物 原位多聚酶链式反应技术 探针的标记物 原位多聚酶链式反应技术 探探针针的的标标记记物物 原原位位多多聚聚酶酶链链式式反反应应技技术术 探针的鉴定 核酸分子原位杂交技术的应用 探针的鉴定 核酸分子原位杂交技术的应用 探探针针的的鉴鉴定定 核核酸酸分分子子原原位位杂杂交交技技术术的的应应用用 原位杂交的实验程序和对照 原位杂交的实验程序和对照 原原位位杂杂交交的的实实验验程程序序和和对对照照 原位杂交（in situ hybridization，ISH）是核酸分子杂交的一部分，是将 组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。 它是用标记了的 已知序列的核苷酸片段作为探针（probe），通过杂交直接在组织切片、细胞涂片、 培养细胞爬片或分裂中期染色体上检测和定位某一特定的靶核苷酸（DNA或RNA） 的存在。核酸原位杂交的生物化学基础是核酸的变性、复性和碱基互补配对结合。 根据所选用的探针和待检测靶序列的不同，核酸原位杂交有DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交等。本章节将就核酸分子原位杂交技术的发展和应 用、探针的种类和标记、用非放射性标记探针行原位杂交的主要操作程序，以及 荧光原位杂交及原位PCR技术等进行介绍。 第一节 核酸分子原位杂交技术的建立和发展 在1969年Pardue等和John在不同的地方几乎同时建立了核酸分子原位杂 交技术。当时，放射性同位素是唯一可用于核酸标记的物质，可用于原位杂交的 3 35 32 14 125 放射性同位素有 H 、 S、 P、 C和 I等。而放射性自显影则是唯一可用于检 测杂交体的方法。由于分子克隆技术尚未建立，原位杂交技术只局限于少数能用 传统的生物化学方法进行纯化和分离的已知核酸序列的检测，如鼠的卫星DNA、 病毒DNA和核小体RNA等。以后，随着核酸分子克隆技术的建立和放射标记方法 的不断完善，Harper等(1981)、Jhanwag等(1984)先后用放射性同位素标记探针 与分裂中期染色体行原位杂交，成功地检测到了长度为数百个核苷酸的序列。 1 Harper等(1986)的工作还发现用放射性同位素标记探针的原位杂交可检测到存 在于单个细胞内的低拷贝数的mRNA分子。随后，放射性同位素标记的寡核苷酸 探针也开始使用，主要用于原位检测mRNA。自原位杂交技术建立以来，尽管它 具有高度敏感性和广阔的应用领域，但仍是在研究性实验室使用，这与放射性污 染、实验耗时和放射性自显影的高成本不无关系。